Экзаменационные вопросы по дисциплине «Спецпрактикум по клеточной и молекулярной биотехнологии»



страница1/6
Дата17.11.2018
Размер1.3 Mb.
ТипЭкзаменационные вопросы
  1   2   3   4   5   6

Экзаменационные вопросы по дисциплине «Спецпрактикум по клеточной и молекулярной биотехнологии»

Гаухар 1. Опишите приготовление 250 мл маточного СТАВ буфера.

Старый 2. Этапы агарозного гель-электрофореза.

Лена 3. Дистилляция воды. Значение.

Лена 4. Значение 2-меркаптоэтанола в выделении нуклеиновых кислот.

Лена 5. Значение поливинилпирролидона в выделении нуклеиновых кислот.

Лена 6. Значение хлороформа в выделении нуклеиновых кислот.

Лена 7. Значение изопропанола в выделении нуклеиновых кислот.

Лена 8. Значение этанола в выделении нуклеиновых кислот.

Старый 9. Правила Чаргаффа.

Мг 10. Приготовление 500 мл 50-кратного ТАЕ-буфера.

Мг 11. Приготовление 1% агарозного геля.

Мг 12. Приготовление ПАА геля.

Лена 13. Эксперименты Гриффитса и Эйвери.

Лена 14. Значение полиаденилирования мРНК.

Гаухар 15. Опишите приготовление 11 реакций ПЦР, объемом 25 мкл.

Саша 16. Стадии реакции обратной транскрипции.

Лена 17. Правила работы с центрифугами.

Тумашбаева 18. Правила работы с амплификатором.

Саша 19. Опишите приготовление 350 мл среды Луриа-Брот.

Саша 20. Значение компонентов ПАА геля.

Тумашбаева 21. Правила работы на спектрофотометре.

Саша 22. Приготовление 300 мл 10-кратного ТВЕ-буфера.

Тумашбаева 23. Документирование агарозных гелей.

Тумашбаева 24. Химические свойства и значение бромистого этидия.

Саша 25. Документация ПАА геля.

Тумашбаева 26. Правила работы в лаборатории и техника безопасности. Подготовка оборудования.

Саша 27. Выделение геномной РНК растений.

Старый 28. Выделение геномной ДНК растений СТАВ методом.

Старый 29. Выделение геномной ДНК растений с использованием протеазы К.

Старый. Методы выделения геномной ДНК животных.

Старый 31. Методы гель-электрофореза нуклеиновых кислот.

Саша 32. Методы трансформации чужеродной ДНК в клетки кишечной палочки.

Старый 33. Методы трансформации чужеродной ДНК в агробактерии.

Старый 34. Методы переноса чужеродной ДНК в растения.

Саша 35. Обратная транскрипция. Значение в генной инженерии.

Саша 36. Методы переноса чужеродной ДНК в клетки животных.

Саша 37. Выделение ДНК фрагментов из агарозного геля.

Тумашбаева 38. Строение нуклеиновых кислот. Модель Уотсона-Крика.

Тумашбаева 39. Проект «Геном человека».

Старый 40. Лак-оперон.

Балжан 41. Создание бинарных матриц и филогенетического древа, установление генетической дистанции.

Балжан 42. Изменение концентрации нуклеиновых кислот и белков.

Тумашбаева 43. Питательные среды, используемые для выращивания E.coli и агробактерий.

Старый 44. Выделение плазмидной ДНК из клеток кишечной палочки.

Саша 45. Нуклеазы. Значение и применение.

46. Агарозный гель-электрофорез нуклеиновых кислот.



Саша 47. Полиакриламидный гель-электрофорез нуклеиновых кислот.

Саша 48. Полиакриамидный гель-электрофорез белков.

Саша 49. Скрининг синих/белых колоний E.coli.

Старый 50. Стадии ПЦР. Значение.

Старый 51. Методы Саузерн-блот гибридизации. Протокол и области применения.

Старый 52. Метод Вестерн-блот гибридизации. Протокол и области применения.

Старый 53. Методы Нозерн-блот гибридизации. Протокол и области применения.

Старый 54. Секвенирование методом Максама-Гилберта.

Старый 55. Секвенирование методом Сэнгера.

Шынар 56. Выделение геномной ДНК дрожжей.

Тумашбаева 57. Рентгеноструктурный анализ. Исследования Розалинды Франклин.

Саша 58. Трансляция у растений.

Старый 59. Векторы. Значение в генной инженерии.

Старый 60. Репликация у эукариот.

Старый 61. Вирусы. Организация генома. Механизмы заражения.

Старый 62. Создание геномных библиотек.

Старый 63. Полимеразная цепная реакция. Значение в генной инженерии.

Шынар 64. Генотипирование. Виды используемых маркеров.

Старый 65. Рентгеноструктурный анализ. Исследования Розалинды Франклин.

Балжан 66. Лигазы. Лигирование ДНК. Значение и области применения.

Балжан 67. Эндонуклеазы. Рестрикция ДНК. Значение и области применения.

Балжан 68. Регуляторные элементы ДНК (промотор, терминатор).

Балжан 69. Методы определения трансгенных растений.

Балжан 70. Понятие компетентности. Получение компетентных клеток кишечной палочки.

Балжан 71. Элюция ДНК из геля.

Балжан 72. Иммуно-ферментный анализ.

Балжан 73. Получение поликлональных антител.

Балжан 74. Диагностика вирусов растений.

Балжан 75. РНК-интерференция.

Балжан 76. Транскрипция in vitro.

Балжан 77. Транляция in vitro.

Мг 78. Хроматография. Аффинная, жидкостная и газовая.

Балжан 79. Получение рекомбинантных белков. Продуценты и этапы.

Старый 80. ПЦР. Стадии. Реакция. Области применения.
1. Опишите приготовление 250 мл маточного СТАВ буфера.

Реагент

Количество для 10 мл

Концентрация

Количество для 250 мл

СTAB (10% в воде)

3 мл

3%

75 мл.

5М NaCl

2,8 мл

28%

70 мл.

0,5М EDTA (pH=8.0)

0,4 мл

4

10 мл.

1М Tris-Cl (pH=8.0)

1 мл

10%

25 мл.

PVP (MW 40kDa)

0,3 г

3%

7,5 г.

β-меркаптоэтанол

0,02 мл

0,2%

0,5 мл.

H2O

2,48 мл

24,8%

62 мл.

Готовить CTAB-буфер надо непосредственно перед использованием, буфер хорош лишь когда он только что приготовлен.

Хранить 10% сток-раствор CTAB при 37°С избегая осаждения. Может храниться при 37°С несколько лет.


2,46. Этапы агарозного гель-электрофореза.

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отр-но и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к полож.аноду. Более длинные мол-ы мигрируют медленнее, т.к. задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс. ЭФ проводится в камере, заполненной буферным р-ром. Чаще всего используются буферы, содержащие EDTA, трис и борную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы р-ра, в к-м будет происходить разделение мол.ДНК под действием приложенного электрического поля. После разделения фрагменты ДНК визуализируют при пом.флюоресцентных красителей, специфично взаим-х с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, к-й интеркалирует м/у азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Опр-е размеров производят путем сравнения фрагментов ДНК с мол.маркером, сод-м линейные фрагменты ДНК известной длины. Исп.агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

Протокол агарозного ЭФ.

Необходимое оборудование: 1) источник питания или трансформатор. 2) камера для электрофореза: а. плашка, б. гребешки в. камера. 3) весы 4) калька для весов 5) мерный цилиндр 500 мл 6) плоскодонная колба 1000 мл 7) плоскодонная колба 500 мл

Необходимые реактивы: 1) ТАЕ-буфер (40х, 50х) (Производство Promega) 2) агароза3) Этидиум бромид – химическое вещество, которое связывается с нуклеиновыми кислотами и дает белое свечение при UV-лучах. 4) краситель 6х Losding dye. Состав 0,025% БФС. 6) 0,025% ксиленцианол 7) 60% глицерин. Обволакивает и группирует образец, придает ему массу. 5 объемов образца+1 объем краски. 5) Молекулярный маркер.

Ход работы: 1) Опр.объем геля (камеры) 2) Приготовить 1х буфер. 3) Взвешиваем 500 мл агарозы. 4) Помещаем в колбу. 5) Доводим объем до 60 мл 1х буфером. 6) Кипятить в зависимости от готовности – до полного р-рения агарозы и прозрачного цвета, до полного р-рения крупиц. 7) Агароза остывает при комн.темп. Помешивать каждые минуту-две. 8) При достижении t=37°C. Доб.1-3 мкл.этидиум бромида, перемешиваем. 9) Заливаем раствор в камеру (плашку), разгоняем пузыри на края плашки. 10) Вставляем сухие гребешки. 11) Ждем полимеризации геля. 12) Аккуратно и резко вынимаем гребешки. 13) Поворачиваем плашку с гелем в нужной ориентации. 14) Наливаем 1х ТАЕ в камеру до полного погружения геля в буфер. 15) Удаляем пузыри из ячеек. 16) Перемешиваем образцы с краской. 17) Наносим на гель. 18) Подключаем источник питания. 19) Выставляем U=50 В. 20) Запускаем аппарат. 21) Через 5 минут поднимаем U=80 В.
3. Дистилляция воды. Значение.

Дистилляция является давно известным и проверенным способом глубокой очистки воды. Принцип дистилляции фактически повторяет круговорот воды в природе. Вода, испаряясь, освобождается практически ото всех растворенных и нерастворенных примесей. В дистилляторах для ускорения естественного процесса испарения воды применяется нагревание воды до температуры кипения, что приводит к интенсивному образованию пара. При этом механические частицы, содержащиеся в воде (включая бактерии, вирусы, а также коллоиды и взвешенные частицы) оказываются слишком тяжелыми, чтобы быть подхваченными паром. Одновременно почти все растворенные в воде химические вещества (включая соли железа, других тяжелых металлов, соли жесткости и т.д.) достигают предела своей растворимости (за счет повышенной температуры и особенно увеличения концентрации - вода-то постоянно улетучивается) и выпадают в осадок. Таким образом, вместе с паром могут "вознестись" только летучие органические соединения (среди которых, правда и такие опасные, как тригалометан - потенциальный канцероген - и другие). Именно поэтому в дистилляторах часто устанавливают фильтр доочистки на основе активированного угля из скорлупы кокоса. В дальнейшем пар, охлаждаясь (в природе - в верхних слоях атмосферы, в дистилляторах - в специальных конденсаторах, простейшим из которых является змеевик), конденсируется, опять превращаясь в воду. Этот конденсат и является той высокоочищенной водой, которую называют дистиллятом. Иногда дистиллированную воду "прогоняют" через дистиллятор еще раз и получают так называемый бидистиллят. Бистиллированную воду достаточно широко используют в промышленности, медицине, в химических лабораториях.


4. Значение 2-меркаптоэтанола в выделении нуклеиновых кислот.

2-меркаптоэтанол (β-меркаптоэтанол, BME, 2BME, 2-ME, β-met) — химическое соединение, производное этиленгликоля и этандитиола.  Восстанавливающий агент, используемый для восстановления дисульфидных связей. Антиоксидант (свободные радикалы). Широко используется, так как гидроксильная группа обеспечивает хорошую растворимость в воде и снижает летучесть. Хим св-ва: 2-меркаптоэтанол взаимодействует с альдегидами и кетонами. Данная реакция делает меркаптоэтанол важной защитной группой. Применение: 1) восстановление дисульфидных связей в белках (некоторые белки денатурируют в присутствии 2-меркаптоэтанола из-за восстановления дисульфидных связей. Восстановление дисульфидных связей приводит к разрушению третичной и четвертичной структуры белков. Поэтому меркаптоэтанол часто используют при исследовании структуры белков, например, для перевода всех молекул белка из олигомерного в мономерное состояние. Однако, из-за того, что 2-меркаптоэтанол образует аддукты со свободными цистеинами и является более токсичным, чем дитиотреитол, в молекулярной биологии и биохимии чаще используют последний, особенно при анализе белков в полиакриламидном геле. 2) Предотвращение окисления белков. 2меркаптоэтанол и другие восстанавливающие агенты добавляют к компонентам ферментативных реакций для ингибирования окисления свободных сульфогидрильных остатков и поддержания белковой активности.
5. Значение поливинилпирролидона в выделении нуклеиновых кислот.

Поливинилпирролидон - водорастворимый полиэлектролит. PVP является замечательным синтетическим полимером. PVP образует с рядом реагентов цветные комплексы, что может быть использовано для его качественной идентификации. PVP образует комплексные соединения, растворимые или диспергируемые в воде, со многими веществами, обычно нерастворимыми, при этом некоторые из таких веществ теряют токсичность. В молекулярной биологии в качестве блокирующего агента в Саузерн-блоте как компонент Денхардт буфера. PVP исключительно хорош в адсорбации полифенола во время очистки ДНК. Полифенолы содержатся в тканях многих растениях и могут деактивировать белки.


6. Значение хлороформа в выделении нуклеиновых кислот.

Бесцветная прозрачная летучая невоспламеняюшаяся жидкость с характерным запахом и жгучим вкусом. Смешивается во всех отношениях с безводным спиртом, эфиром, бензином, эфирными и жирными маслами; не смешивается с глицерином. Мало растворим в воде (1 : 200). Температура кипения 59 – 62 градусов. Под влиянием света и при доступе воздуха разлагается с образованием фосгена, хлористого водорода, хлора и муравьиной кислоты. Консервируют прибавлением 0,6 - 1% безводного спирта.

Смесь хлороформа и изоамилового спирта (24: 1, по объему) используют для удаления белков из препаратов нуклеиновых кислот. Хлороформ денатурирует белки, а изоамиловый спирт уменьшает пенообразование во время экстракции, в результате

чего происходит более четкое разделение водной и органической фаз. Ни один из этих реагентов не требует обработки перед использованием. Смесь стабильна и может храниться в закрытом сосуде при комнатной температуре.
7. Значение изопропанола в выделении нуклеиновых кислот.

Бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом, более резковатым по сравнению с этанолом. Хим.: CH3CH(OH)CH3. Обладает св-вами вторичных спиртов жирного ряда, в т.ч.обр.пр.и сл.эфиры. Гидроксильная группа может быть вытеснена представителями ряда галогенов. С ароматическими соединениями изопропиловый спирт конденсируется с образованием производных, таких как изопропилбензол и изопропилтолуол. В изопропаноле хорошо растворяются многие эфирные масла, алкалоиды, некоторые синтетические смолы и другие химические соединения. Смесь хлороформа и изоамилового спирта (24: 1, по объему) используют для удаления белков из препаратов нуклеиновых кислот. Хлороформ денатурирует белки, а изоамиловый спирт уменьшает пенообразование во время экстракции, в результате чего происходит более четкое разделение водной и органической фаз. Ни один из этих реагентов не требует обработки перед использованием. Смесь стабильна и может храниться в закрытом сосуде при комнатной температуре. Поскольку ДНК является нерастворимым в этаноле, изопропаноле, добавление спирта с последующим центрифугированием, приведет к осаждению белков из раствора. Если концентрация ДНК в растворе высокая, то добавление этанола немедленно вызовет выпадение белого осадка. Если концентрация ДНК в образце является низкой, лучше использовать изопропанол для осаждения доступных белков. Кроме того, изопропанол часто используется для осаждения ДНК из больших объемов. Этанол и изопропанол также могут смывать остатки соли.
8. Значение этанола в выделении нуклеиновых кислот.

Этано́л — одноатомный спирт с формулой C2H5OH. Внешний вид: в обычных условиях представляет собой бесцветную летучую жидкость с характерным запахом и жгучим вкусом. Этиловый спирт легче воды. Является хорошим растворителем других органических веществ.

Поскольку ДНК является нерастворимым в этаноле, изопропаноле, добавление спирта с последующим центрифугированием, приведет к осаждению белков из раствора. Если концентрация ДНК в растворе высокая, то добавление этанола немедленно вызовет выпадение белого осадка. Если концентрация ДНК в образце является низкой, лучше использовать изопропанол для осаждения доступных белков. Этанол и изопропанол также могут смывать остатки соли.
9. Правила Чаргаффа.

Для состава ДНК характерны закономерности, известные в качестве правил А. Чаргаффа, а именно:

1. Количество аденина равно количеству тимина, а гуанина - цитозину: А=Т, Г=Ц.

2.Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Т+Ц.

3.Количество оснований с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с кетогруппами в положении 6: А+Ц=Г+Т.

4.Вместе с тем, соотношение (A+Т):(Г+Ц) может быть различным у ДНК разных видов. У одних преобладают пары АТ, в других — ГЦ.


10. Приготовление 500 мл 50-кратного ТАЕ-буфера.

Трис-ацетатный буфер (TAE) — буферный р-р, содержащий трис, ускусную к-ту и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную к-ту). Исп-ся в молекулярной биологии в основном для гель-электрофореза при разделнии фрагментов НК.



Приготовление 500 мл 50-кратного ТАЕ-буфера:

Компонент

Конц-ция

Необходимый объем

TRIS



121,1 г

Уксусная к-та

2,5М

9,31 г

EDTA рН8,0

0,5М

44,8 мл

Объем довести водой до 500 мл.
11. Приготовление 1% агарозного геля.

Для приготовления агарозного геля необходимо взвесить 500 мг агарозы и поместиь в колбу объемом 100 мл. Добавить 60 мл 1хТАЕ буфера. Полученный раствор помещают в микроволновую печь (на 2 - 5 мин, в зависимости от мощности печи - следить за интенсивностью кипения суспензии!) или кипятят на водяной бане 15 мин до полного растворения агарозы и прозрачного цвета.

Расплавленную агарозу охлаждают до37 °С и добавляют 1-3 мкл бромистого этидия, тщательно перемешивают.

Расплавленную агарозу с бромистым этидием разливают в камеру, разгоняя пузырьки на края камеры и затем вставляем гребенку.

Через 30 - 40 мин удаляют гребенку. Готовый гель можно использовать сразу, можно хранить в 1х буфере в холодильнике при 4 °С .
12. Приготовление ПАА геля.

ПААГ для выделения белков.

Для приготовления разделяющего геля смешать компоненты (за исключением ТЕМЕД и ПСА) в соответствии с данными, приведѐнными в табл. 1. (для разных объѐмов!). Полученную смесь тщательно перемешать.

Таблица 1. Подготовка разделяющего геля


Компонент

3%

6%

10%

20%

Р-р АА/бисАА

1 мл

3 мл

4,95 мл

13,34 мл

Буфер 2

2,5 мл

3,75 мл

3,75 мл

5 мл

Н2О

6,5 мл

8,25 мл

6,3 мл

1,66 мл

ТЕМЕД

10 мкл

15 мкл

15 мкл

40 мкл

ПСА 5%

30 мкл

45 мкл

45 мкл

120 мкл

V общий

10 мл

15 мл

15 мл

20 мл

Буфер 2 (нижний буфер для разделяющего геля): Tris–OH - 18,17 г; SDS - 0,4 г; Н2О - до 100 мл. pH 8,8, титровать до нужного значения HCl, перед SDS.

Добавить последовательно ТЕМЕД и ПСА и тщательно перемешать полученный раствор, при этом важно, чтобы в процессе перемешивания не образовывались пузырьки с газом.



Для приготовления концентрирующего геля смешать компоненты (за исключением ТЕМЕД и ПСА) в соответствии с данными, приведѐнными в табл. 2. (для разных объѐмов!). Полученную смесь тщательно перемешать.

Таблица 2. Подготовка концентрирующего геля

Компонент

6%

10%

Р-р АА/бисАА

2 мл

3,3 мл

Буфер 1

2,5 мл

2,5 мл

Н2О

5,5 мл

4,2 мл

ТЕМЕД

20 мкл

10 мкл

ПСА 5%

60 мкл

30 мкл

V общий

10 мл

10 мл

Буфер 1 (для концентрирующего геля): Tris–HCl - 6,06 г; SDS - 0,4 г; Н2О - до 100 мл. pH 6,8, титровать 4–6 н HCl, перед добавлением SDS

Добавить последовательно ТЕМЕД и ПСА и тщательно перемешать полученный раствор, при этом важно, чтобы в процессе перемешивания не образовывались пузырьки с газом.



ПААГ для выделения ДНК.

8% ПААГ. Для приготовления 100 см3 раствора требуется 26,7 мл. (30% АА) + 20 мл ТВЕ (5Х). Раствор доводят до 100 см3 дист. водой. (30% раствор акриламида (АА): для приготовления 100 см3 раствора требуется 29,0 г. АА + 1,0 г бисакриламида. Раствор доводят до 100 см3 дист. водой). Срок хранения при температуре 4°С- не более 12 мес.

Разделяющий гель: 30 мл 8% АА, добавляем 113 мкл 10% PSA и 48 мкл ТЕМЕД, перемешиваем и заливаем в камеру.
13. Эксперименты Гриффитса и Эвери.

1928г. Опыты Фредерика Гриффита. Гриффит работал с пневмококками – бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Вирулентность бактерии определяется наличием мукополисахаридной капсулы, расположенной па поверхности клетки. Эта капсула защищает бактерию от воздействий со стороны организма-хозяина. В результате, размножившиеся бактерии убивают зараженное животное. Бактерии этого штамма (S-штамм) образуют гладкие колонии. Авирулентные формы бактерий не имеют защитной капсулы и образуют шероховатые колонии (R-штамм). Гриффит инъецировал мышам живого пневмококка R-штамма вместе с S-штаммом, убитым высокой температурой (65°С). Через некоторое время ему удалось выделить из заражённых мышей живых пневмококков, обладающих капсулой. Оказалось, что свойство убитого пневмококка - способность образовывать капсулу перешло к живой бактерии, т.е. произошла трансформация. Т.к признак наличия капсулы является наследственным, то это означало, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма S перешла к клеткам штамма R.

В 1944 году эксперимент был повторен О.Т. Эвери, К.М. Маклеодом и М. Маккарти. Они показали, что такое же превращение типов пневмококков может происходить в пробирке. Эти исследователи установили существование особой субстанции "трансформирующего принципа"-экстракта из клеток штамма S, обогащенного ДНK. ДНK, выделенная из клеток S-штамма добавленная в культуру R-штамма, трансформировала часть клеток в S-форму. Клетки передавали это свойство при дальнейшем размножении. Обработка "трансформирующего фактора" ДНК-азой, ферментом разрушающим ДНK, блокировала трансформацию. Эти данные показали, что именно ДНК, а не белок является наследственным материалом.
14. Значение полиаденилирования мРНК.

После инициации транскрипции происходит котранскрипционная модификация 5'-конца мРНК. Полиаденилирование происходит либо непосредственно после терминации транскрипции, либо после специфического расщепления растущей цепи РНК. Конкретные функции poly(A) неизвестны, но считается, что такой "хвост" способствует последующему процессингу РНК и экспорту зрелых молекул мРНК из ядра. Созревание 3'-конца мРНК является двухэтапным процессом. Вначале предшественник теряет 3'-концевую некодирующую последовательность, после чего, как правило, к 3'-концу присоединяется поли(А)-последовательность путем ферментативной полимеризации остатков AMP. Места отщепления 3'-концевых некодирующих последовательностей в мРНК животных маркированы специальными последовательностями нуклеотидов. Имеются две такие последовательности, образующие сайты полиаденилирования, или поли(А)-сайты. Процесс полиаденилирования начинается сразу за расщеплением РНК и происходит настолько быстро, что неполиаденилированных промежуточных продуктов не обнаруживается. Такое сопряжение двух реакций необходимо для защиты 3'-концевых последовательностей РНК от деградации нуклеазами. Процессивное полиаденилирование 3'-концов РНК происходит со скоростью около 25 нуклеотидов/с до тех пор, пока длина поли(А)-последовательности не достигнет примерно 250 нуклеотидов. После этого процессивная реакция прекращается, и происходит медленное дистрибутивное присоединение остатков AMP разными молекулами поли(А)-полимеразы. Только транскрипты, синтезированные РНК-полимеразой II, обладают 5'- кэпами и 3'-поли-А хвостами. Причиной этого является то, что ферменты, опосредующие кэпирование и расщепление с последующим полиаденилированием, специфически связаны с РНК-полимеразой II.


15. Опишите приготовление 11 реакций ПЦР, объемом 25 мкл.

Протокол ПЦР.





1) При замешивании ПЦР пробирки помещаем на лед. Компоненты оттаивают на льду.

2) Готовим пробирки по 0,2 ml, подписываем.

3) 82 μl воды. Компоненты по порядку. Перемешиваем.

4) Добавляем по 23 μl mix.

5) Краткое ЦФ.

6) Добавляем по 2 μl DNA.

7) Закрываем, перемешиваем, убираем пузыри.

8) ПЦР

1) Td=94°C 4'

2) Tdc=94°C 30''

3) Ta=37°C 1'

4) Te=72°C 3'

5) Tex=72°C 10'

6) Ts=4°C 10'

9) После окончания ПЦР в пробирки добляем 6 μl loading dye, тщательно перемешиваем пипетированием.

10) Гель ЭФ.
16. Стадии реакции обратной транскрипции.

Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении. Геном ретровирусов – 2 молекулы кэпированной и полиаденилированной (+)РНК размером 8-10 т.н. На 5’- и 3’-концах РНК имеет прямые повторы (R), уникальные послед-ти (U5 и U3, соответственно) и на 5’-конце участок присоединения тРНК (Р). В результате реакции обратной транскрипции образуются молекулы двухнитевых ДНК с длинными (несколько сотен нуклеотидов) концевыми повторами (LTR), имеющими структуру U3RU5. При синтезе минус-нити ДНК у ретровирусов затравка необычна, ее роль выполняют клеточные транспортные РНК. Для каждого вируса это определенная тРНК, попадающая в вирион в процессе инкапсидации геномной РНК. Реакция обратной транскрипции у ретровирусов многостадийный процесс, включающий «прыжки» - ревертазы. Возможность прыжков обеспечивается наличием на концах матрицы прямых повторов (R) и активностью РНКазы Н. этапы реакции обратной транскрипции генома ретровирусов.

1. Геномная РНК

c:\users\дом\desktop\pic00184.png

2. Наращивание 3’-конца тРНК с образованием 5’-ДНК-РНК дуплекса



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

3. РНКаза Н удаляет 5’-конец РНК



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

4. Ревертаза делает первый прыжок на 3’-конец РНК



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

5. Ревертаза синтезирует кДНК



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

6. РНКаза Н удаляет РНК из дуплекса, оставляя затравку в области Pu



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

7. Ревертаза синтезирует 3’-конец второй цепи



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

8. РНКаза Н удаляет затравку и тРНК



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

9. Второй прыжок



c:\users\дом\desktop\pic00184.png

10. Синтез обеих цепей завершен



c:\users\дом\desktop\pic00184.png
17. Правила работы с центрифугами.

Центрифуга предназначена для центрифугирования жидкостей, для получения чистой жидкой фракции, полностью отделенного от осадочных биологических материалов. Центрифуги отличаются по скорости вращения ротора.

Подготовка к работе 1. Поставить центрифугу на горизонтальную плоскость и надежно заземлить. 2. При работе со стеклянными пробирками проверить наличие резиновой прокладки в каждой ячейке ротора. 3. Открыть крышку центрифуги нажатием на кнопку замка. При работе на центрифуге МРW –310 сначала включить в сеть, нажать на самую нижнюю кнопку на передней панели пульта управления, после этого, чтобы открывать крышку нажать на верхнюю кнопку. 4. Проверить плотность насадки ротора на вал электродвигателя. 5. Каждую пару наполненных и уравновешенных пробирок размещать в диаметрально противоположных ячейках. 6. Плотно закрыть ротор, крышкой навинтив ее на вал электродвигателя против часовой стрелки. 7. Закрыть крышку центрифуги до щелка в замни. 8. Поставить ручку переключателя скорости вращения ротора в положения "Вкл". Порядок работы 1. Подключить центрифугу к источнику питания, в случае с центрифугой типа МРW-310 нажать еще на нижнюю кнопку на передней панелей пульта управления. 2. При работе центрифуги без часов- поставить тумблер в положение "Без часов" - по вернуть ручку переключателя в положение "2". Перед каждым последующим переключением ручки переключателя в сторону увеличения числа оборотов ротора необходимо выдержать не менее 50сек. При работе на центрифуге МРW-310 для запуска ротора нажать на среднюю кнопки. 3. По окончание работы скорость ротора, снижая постепенно поставить ручку в положение "0" 4. После остановки ротора открыть крышку центрифуги, отвинтить крышку ротора и вынуть пробирки. Отключить центрифугу от источника питания. При работе центрифуги с часами оттянуть ручку электрочасов и в точном положении по часовой стрелке повернуть до деления, соответствующего необходимый выдержке времени. Поставить тумблер в положение "С часами".Категорически запрещается 1. работать без заземления 2. включать центрифугу без установленного ротора 3. работать с открытыми крышками ротора и центрифуги 4. размещать в роторе нечетное число пробирок 5. подключать центрифугу к источнику питания постоянного тока. 6. Время непрерывной работы центрифуги не должно превышать 1 час;

последующее включение разрешается только через 20-25 мин. Перед каждым включением центрифуги ручка должно стоять в положении "0"


18. Правила работы с амплификатором.

Амплификатор — прибор, обеспечивающий периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы.

1ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ

1.1. Прибор представляет собой многоканальный программируемый терморегулятор и предназначен для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинико-диагностических и научных лабораториях.

1.2. Работа прибора сопряжена с выделением тепла. Не следует устанавливать прибор вблизи нагревателей или на прямом солнечном свету, а также препятствовать естественной вентиляции корпуса, загромождая пространство вокруг него.

1.3. К работе с прибором допускается персонал лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж.

1.4. Во время работы предусматривается использование спецодежды (халат) и СИЗ в виде марлевых повязок и защитных очков.

2 ТРЕБОВАНИЯ ПЕРЕД НАЧАЛОМ РАБОТЫ

2.1. Перед началом работы необходимо убедиться, что прибор правильно заземлен, включен в сеть переменного тока, розетка, вилка и соединительный шнур не повреждены. Перед включением прибора в сеть убедитесь, что розетка обеспечивает необходимое заземление.

2.2. Избегайте попадания на корпус прибора каких-либо жидкостей.

2.3. Запрещается:

- работать с незаземленным прибором или неисправным контуром заземления;

- включать в сеть при наличии видимых повреждений розетки, вилки и соединительного шнура.



3 ТРЕБОВАНИЯ ВО ВРЕМЯ РАБОТЫ

3.1 По возможности, симметрично располагайте пробирки в термоблоке.

3.2. Если прибор используется в течение дня периодически, то лучше оставлять его включенным в течение всего дня.

4 ТРЕБОВАНИЯ В АВАРИЙНЫХ СИТУАЦИЯХ

4.1. В аварийных ситуациях необходимо отключить прибор от сети и сообщить о неисправности руководителю. Все работы по ремонту и чистке производятся при отключении электроприбора от сети.

4.2. Запрещается разбирать прибор, не отключив его от сети.

5 ТРЕБОВАНИЯ ПО ОКОНЧАНИИ РАБОТЫ

5.1. Следите за чистотой лунок в термоблоках. Старайтесь держать крышки термоблоков закрытыми. При интенсивной эксплуатации прибора не реже 1 раза в месяц протирайте лунки смоченным в спирте ватным тампоном. Не пользуйтесь для этого металлическими предметами.


19. Опишите приготовление 350 мл среды Луриа-Брот.

На 1л.: бакто-триптон: - 10г., бакто-дрожжжевой экстракт - 5 г., NaCl – 10 г.

На 350 мл.: бактотриптон – 3,5 г., бакто-дрожжевой экстракт: 1,75 г., NaCl – 3,5 г.

Доведите рН до 7,5 с помощью NaOH.


20. Значение компонентов ПАА геля.

Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки – обычно N,N'- метиленбисакриламид (бисакриламид). Реакция полимеризации протекает по свободнорадикальному механизму и требует наличия свободных радикалов акриламида. В качестве инициаторов реакции полимеризации используют вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов, которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и запускают (инициируют) полимеризацию. В качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония, образующий в водном растворе за счет гомолитического разрыва связи радикалы. Гомолитический разрыв связи между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония приводит к образованию двух свободных радикалов с одним неспаренным электроном у атома кислорода. Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома углерода: этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы акриламида с образованием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. Поскольку реакция полимеризации акриламида – медленный процесс, то для ускорения процесса полимеризации в качестве катализатора обычно используют N,N,N',N'тетраметилэтилендиамин (TEMED). SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд. Белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии; количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе; собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS. Состав буферов, используемых для электрофореза белков и нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации акриламида.


21. Правила работы на спектрофотометре.

Спектрофотометр- прибор для исследования спектрального состава по длинам волн электромагнитных излучений в оптическом диапазоне, нахождения спектральных характеристик излучателей и объектов, взаимодействовавших с излучением, а также для спектрального анализа и фотометрирования.

Спектрофотометр предназначается для измерения коэффициента пропускания (оптической плотности) жидких и твердых веществ в области спектра от 186 до 1100 нм. Источник питания 220 Вт.



Принцип действия прибора

Эталон и образец поочередно устанавливаются на пути света определенной длины волны, выходящего из монохроматора. На спектрофотометре измеряется коэффициент пропускания (оптическая плотность) образца относительно эталона воздуха, которая принимается за 100%, а оптическая плотность 0. Отношение светового потока, прошедшего через образец, к световому потоку, прошедшего через эталон (воздух) определяется по шкале отчетного потенциометра



Включение прибора

1. Подключить к стабилизатору при помощи шлангов 92 и 94 усилитель, отчетное устройство и источники света.

2. Вынуть из гнезд 87 и 88 на стабилизаторе короткозамкнутые вилки и подключить амперметр переменного тока на 2,5-5 а к гнездам "ток накала", а миллиамперметр на 500-750 ма – к гнездам "разрядный ток".

3. Проверить, находится ли рукоятка 82 в положении "выкл".

4. Повернуть рукоятку 81 влево до упора.

5. Включить тумблером 83 в цепь стабилизатора требуемую лампу.

6. Заземлить стабилизатор и включить его в сеть при помощи шланга 90.

7. При работе с лампой накаливания поставить рукоятку 82 в положение "накал" и нажать кнопку 84; после того как ток стабилизатора установится 300 ма и прогреется нить накала лампы, рукоятку 82 поставить в положение "лампа накал".

При работе с дейтериевой или ртутной лампами поставить рукоятку 82 в положение "накал" и, вращая рукоятку 81, установить движок потенциометра в положение, при котором пусковой ток накала лампы соответствует указанному в паспорте. После двухминутного прогрева нити накала лампы нажать кнопку 84 и вращая рукоятку 81, снизить ток накала до значения рабочего тока, указанного в паспорте лампы.

8. Прогреть прибор в течение 10 минут; если величина тока отличается от 300 ма, то установить ее вращая ось 85 потенциометра.



Выключение прибора производится в обратном порядке.

Для выключения лампы накаливания после дейтериевой лампы переключить тумблер 83 в положение "лампа накаливания". После двухминутного прогрева нити накала лампы рукоятку 82 поставить в положение "лампа накал".

Для включения после лампы накаливания дейтериевой или ртутной лампы нужно выключить прибор, а затем включить как указано выше.

Дейтериевую и ртутную лампу следует распаковывать осторожно.


22. Приготовление 300 мл 10-кратного ТВЕ-буфера.

Приготовление 1х ТВЕ буфера для электрофореза. В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения. Сделаем расчеты 1х на 300 мл. Триса: 10,8 /1000 * 300 = 3,24 мг. Борной к-ты: 5,5/1000*300 = 1,65г. ЭДАТ к-ты: 0,92/1000*300 = 0,276. Проведем расчеты для 10х. Триса: 3,24*10 = 32,4. Борной к-ты: 1,65*10 = 16,5 и ЭДАТ 0,276*10= 2,76

Ответ: Для приготовления 300 мл 10-кратного ТВЕ-буфера, необходимо: Триса 32,4 мг; Борной к-ты 16,5 г; этилендиаминтетрауксусной к-ты: 2,76 г. и довести объем до метки 300 мл.
23. Документирование агарозных гелей.

Агароза, природный продукт, который выделяют из морских водорослей, является линейным полисахаридом (Mr~ 12 000 Да), образованным повторяющимся элементом – агаробиозой, которая в свою очередь состоит из чередующихся элементов: галактозы и 3,6- ангидрогалактозы. Агароза очень хрупка и легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением смеси до того момента, когда агароза расплавится и образует прозрачный раствор. Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры, чтобы сформировать прочный гель. Про застывании агароза формирует матрикс, плотностью которого определяется консистенция. Буферы для электрофореза обычно готовят в виде концентрированных растворов и хранят при комнатной температуре. Образцы ДНК, которые будут наносится на агарозный гель, сначала смешиваются с буфером для нанесения, обычно содержащем воду, сазарозу и краситель. Максимальное количество ДНК которое можно нанести, зависит от числа фрагментов. Минимальное количество ДНК, которое может быть выявлено на снимках геля, окрашенного бромистым этидием, составляет около 2 нг в полосе, шириной 0,5 см. Если в полосе такой ширины находится более 500 нг ДНК, значит дорожка перегружеа, что приводит к размыванию полосы. Процедура элеrтрофореза. 1. Заклейте края чистых, сухих пластиковых подложек для геля либо клейкой лентой, либо другим способом. Вставьте соответствующую гребенку, так чтобы образовались лунки при добавлении агарозного раствора. 2. Разведите 10х TBE буфер для приготовления соответствующего количества 0,5х TBE буфера, для заполнения электрофоретической камеры и приготовления геля. 3. Взвесьте сухую агарозу и добавьте ее к соответствующему количеству 0,5х TBE буфера. 4. Нагрейте взвесь агарозы в микроволновой печи или на бане с кипящей водой до растворения агарозы 5. Охладить смесь до 50-60 0C, добавьте бромистый этидий до конечной концентрации 0,2 мкг/ мл и тщательно перемешайте 6. Залейте раствор на подложку для геля, и дайте гелю застыть. Количество использованного геля должно соответствовать образованию слоя толщиной около 3-5 мм. 7. После того как гель полностью сформируется, аккуратно удалите гребенку и ленту, и поместите гель в элtктрофоретическую камеру. 8. Добавьте достаточно количество 0,5х TBE буфера в прибор для электрофореза, чтобы гель был покрыт слоем буфера около 2-5 мм. 9. Наносим 10 мкл каждого образца в последовательно расположенные лунки, а соответствующие ДНК маркеры в первую и последнюю лунки 10. Закройте крышку электрофоретичtской камеры и подсоедините электропровода таким образом, чтобы ДНК перемещались в сторону анода, подайте напряжение 5-10 V/см 11. Продолжайте электрофорез до того момента, когда ксиленцианол пройдет надлежайшее расстояние в геле(~40-60 минут) 12. Отключите ток, отсоедините провода и крушку электрофоретической камеры. Поместите гель на фильтр УФ трансиллюминатора и сфотографируйте гель.


24. Химические свойства и значение бромистого этидия.

Бромистый этидий — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот в молекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле. При освещении ультрафиолетовым светом, EtBr флюоресцирует оранжевым цветом, интенсивность флюоресценции увеличивается примерно в 20 раз при связывании с ДНК. Из-за возможности связывания с ДНК, и при освещении ультрафиолетом, стимулирования разрывов в ДНК, EtBr м.б.сильным мутагеном. Также считается канцерогеном и тератогеном. Явл.ароматич.соед. Основой гетероцикла явл.фенантридин. Фенильная группа оказывается почти перпендикулярной плоскости кольц. сист., т.к. она вращается вокруг своей одинарной связи. При перемещении в эту среду, катион этидиума вынужден терять все молекулы воды, связанные с ним. Поскольку вода явл.высокоэффективным гасителем люминесценции, ее удаление позволяет этидиуму светиться. Т.к УФ-свет вреден для глаз и кожи, гели, окрашенные EtBr обычно рассматриваются косвенно, исп-я закрытые камеры, с флуоресцентными изображениями, записанными в виде фотографий. Этидий бромид также широко исп-ся для уменьшения числа копий митохондриальной ДНК в пролиферирующих клетках. Интенсивность окраски бромистым этидием зависит от размеров рестриктов: зоны крупных рестриктов удается выявить при наличии 30 - 50 нг в полосе. Для выявления мелких рестриктов необходимо иметь 200 - 500 нг фрагмента ДНК в каждой полосе.



25. Документация ПАА геля.

1. НК. После ЭФ в глубокий сосуд прямоугольной формы наливается раствор бромистого этидия, к-й разводится из маточного р-ра 100 мг/мл в конц.1:10. Гель помещается в сосуд и доливается EtBr до полного погружения гель в него. Инкубируется при комн.темп.10-15' при медленном перемешивании. Р-р EtBr сливается в посуду, гель отмывается от остатков красителя путем инкубирования геля в бидист.воде 10' при комн.темп.и медленном перемешивании. После этого вода сливается, гель полоскается водой 2 р. Фотографируется с пом.гель-документирующей сист.

2. Белки. После завершения ЭФ гель окрашивается с пом.кумаси синего, р-ренного в укусуной к-те путем инкубации при комн.темп.30'. Отмывание геля от остатков красителя осущ-ся путем погружения геля в р-р изопропанол:уксусная к-та=1:1 1час при комн.темп.при постоянном перемешивании. Фотографию геля получают с пом.обычного сканера. Помещают с 2х сторон геля ус-во, препятствующее касанию крышки сканера с гелем. Помещается стекло, на стекло – белый лист бумаги, крышка сканера закрывается и осущ-ся фотографирование геля.

26. Правила работы в лаборатории и техника безопасности. Подготовка оборудования.

При работе в химической лаборатории необходимо соблюдать следующие правила:

1) Работа должна быть предварительно спланирована учащимся и одобрена преподавателем, 2) В лаборатории следует работать в халате, волосы должны быть собраны. 3) Строго запрещается принимать в лаборатории пищу. 4) До и после выполнения работы необходимо вымыть руки. 5) Работать нужно аккуратно, результат опыта зависит от чистоты проведения эксперимента. 6) Все опыты с ядовитыми и пахучими веществами выполнять в вытяжном шкафу. 7) Химические реактивы брать только шпателем, пинцетом или ложечкой (не руками!). 8) Неизрасходованные реактивы не высыпать и не выливать обратно в те сосуды, откуда они были взяты. 9) Работу с твердыми щелочами проводить только в защитных очках и перчатках. 10) При нагревании растворов и веществ в пробирке необходимо использовать держатель. Отверстие пробирки должно быть направлено в сторону от себя и других работающих.

11) Запах вещества следует определять осторожно, направляя воздух над склянкой или пробиркой легким движением руки к себе. 12) При разбавлении серной кислоты следует строго соблюдать правило - добавлять кислоту в воду! 13) Попавшую на лицо или руки кислоту необходимо тотчас же смыть сильной струей воды и на обожженное место наложить повязку из ваты, смоченной разбавленным раствором питьевой соды. 14) Попавшую на лицо или руки щелочь следует тотчас же смыть сильной струей воды и положить повязку из ваты, смоченной разбавленным раствором борной кислоты. 15) поврежденную горячими предметами кожу следует смочить раствором пермаганата калия. 16) необходимо остерегаться отравления такими газообразными веществами, как хлор, пары брома, сероводород, оксид углерода (II). В случае отравления следует вынести пострадавшего на воздух и обратиться к врачу.


27. Выделение геномной РНК растений.

На начальном этапе выделения ДНК из клеток растений требуется эффективное разрушение клеточных стенок. При этом очень важно свести к минимуму процессы фрагментации ДНК. Иногда эту трудность можно преодолеть при использовании лиофилизированного материала. На следующем этапе важно провести очистку освободившейся высокомолекулярной ДНК от многочисленных примесей, присутствующих в растительном экстракте – полисахаридов, белков, липидов, пигментов и других. Поэтому возникает необходимость выбора метода под новый объект экспериментальным путем. Разрушение клеток обычно проводят механическим путем в водных растворах в присутствие детергентов, растворяющих клеточные мембраны, и хелатирующих агентов, подавляющих нуклеазную активность. Для очистки от белковых примесей используют экстракцию фенолом или депротеинизируют препараты ДНК с помощью протеиназы. Процедура дальнейшей очистки препарата в большей степени зависит от целей эксперимента. Концентрируют ДНК осаждением этанолом или изопропанолом. Для того, чтобы получить высокоочищенные ДНК, не содержащие ингибирующих примесей, необходимо использовать наиболее подходящие методы выделения. Неполное удаление ингибиторов, полисахаридов и полифенолов приводит к угнетению ферментативных реакций и вызывает деградацию ДНК после длительного хранения. Традиционные методы выделения ДНК, которые основываются на использовании этанола для осаждения ДНК, приводят к тому, что полисахариды выпадают в осадок совместно с ДНК. Растворы. 2xCTAB буфер, 5xCTAB буфер, Буфер для преципитации, HS-TE буфер. 1. ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелёной (а не темно-зелёной) пудры; 2. подготовить прогретую до 65оС пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25ml 2x CTAB на 2 - 5g ткани); 3. перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать; 4. инкубировать при 65оС минимум 20' (лучше 1h, но можно и больше: 2 - 3h); 5. охладить до NT, добавить равный объём Хлороформа:Изоамилового спирта (Ch:I=24:1), перемешивать ~20' NT; 6. ЦФ 5krpm NT, 10'; 7. снять водную фазу, добавить к ней 0.2V 5xCTAB; 8. перемешать, инкубировать при 65оС 10'; 9. добавить равный объём Ch:I, перемешивать ~10' NT; 10. ЦФ 5krpm NT, 10'; 11. если раствор мутный или большая интерфаза - повторить экстракцию Ch:I (пункты 9 и 10); 12. добавить равный объём буфера для преципитации (можно и 2 - 3 объёма), перемешать и оставить на 1h (или на ночь) при NT; 13. ЦФ 5 - 8 krpm NT, 20' (если ДНК не выпадает, добавить больше буфера для преципитации, оставить на комнатной температуре на 1h, отцентрифугировать); 14. растворить осадок в 1 - 2 ml HS-TE (иногда необходим нагрев до 65оС); 15. добавить 2V EtOH (абс.), 1 - 2h при -20оС или 30' при -70оС; 16. ЦФ 8 krpm 4оС, 10'; 17. к осадку добавить 200µl дистиллированной H2O и 100µl 7.5M NH4Ac (pH 7.5) 20', 0оС; 18. ЦФ 13 krpm 4оС, 10'; 19. добавить к супернатанту 2V EtOH (абс.) 20' при -70оС; 20. ЦФ 13 krpm 4оС, 10'; 21. сполоснуть 80% EtOH; 22. растворить в TE или H2O; 23. хранить при -20оС.
28. Выделение геномной ДНК растений с применением СТАВ-буфера.

Необходимое оборудование и расходные материалы: 1) водяная баня 60°С 2) центрифуга

3) микропипетки переменного объема 4) фарфоровые ступки и пестики (4-6) 5) носики Eppendorf 2 и 1,5 мл 6) ёмкость для мусора – 2 (для жидкости и для носиков) 2,5% раствора белизны 7) поплавок 8) штатив для пробирок Eppendorf 9) холодильники +2 и +8°С.

Необходимые реактивы: 1) хлороформ 2) 96% этанол 3) 75% этанол 4) РНК-аза А 5) 5 М NaCl 6) * изопропанол 7) бидистилированная вода 8) СТАВ-буфер, разогретый до 60°С



Ход работы: 1) 100 мг растительного материала растирается в 1 мл.СТАВ-буфера в фарфоровой посуде до однородного состояния. 2) Содержимое чашки переносится в пробирку, перемешивается плавным инвертированием 20-25 раз 3) инкубация при 60°С 30 минут на водяной бане (перемешивать инвертированием каждые 5-7 минут) 4) пробирки охладить до комн.темп., доб.равный объем хлороформа. Примерно 800-1000 мкл. 5) Плотно зажав крышку, перемешивать инвертированием 20-25 раз 6) ЦФ. 15 минут. 6 тысяч об/мин при комн.темп. 7) Надосадочную жидкость переносим в чистую пробирку. Самое главное - чистота препарата, а не его объем 8) Доб.пол.объема 0,5 М NaCl и 2,5 объема 96% этанола. Перемешать инвертированием 20-25 раз, плотно закрыв крышку. 9) Инкубировать 20 минут +4°С 10) ЦФ 3' 3 тыс.об/мин, затем 3' 6 тыс.об/мин 11) Сливаем надосадочную жидкость, к осадку доб.500 мкл 75% этанола, промываем осадок пипетированием до его всплытия в спирт. 12) ЦФ 10' 13 тыс.об/мин (и тут же написано 3' 3 тыс.об/мин, 3' 6 тыс.об/мин) 13) Надосадочная жидкость сливается, осадок сушится с открытой крышкой при комн.темп. 30' до полного отсутствия запаха спирта. 14) Осадок р-ряем в 50 мкл.дд воды. 15) Кач.и кол.выделенной ДНК опр-ся с пом.ЭФ.
29. Выделение геномной ДНК растений с использованием протеазы К.

Необходимое оборудование: 1) водяная баня, 55°С. 2) ЦФ 3) Микропипетки переменного объема, носики, пробирки объемом 2 мл. 4) Фарфоровые ступки, пестики. 5) Фильтровальная бумага. 6) Весы. 7) Штатив. 8) Ножницы, спирт, вата. 9) Источник питания. 10) Камера для ЭФ.

Необходимые реактивы: 1) хлороформ. 2) Изопропанол. 3) СДС. 4) Протеиназа К. 5) 70% этиловый спирт. 6) Агароза. 7) Этидиум бромид. 8) 6х loading dye – краска для ЭФ. 9) буфер для растирания. Состав: 0,4 М NaCl; 100 мМ трис-HCl, рН=8; 20 EDTA, рН=8.

Ход работы: 1) 2 семечка растирают в 800 мкл буфера для растирания до гомогенного состояния. 2) Доб. протеиназы К до концентрации 400 мкг/мл. 3) Доб. СДС до концентрации, равной 2%. 4) Перемешиваем. 5) Инкубировать при 55°С 1,5-2 часа. Каждые 10' перемешиваем. 6) Доб.равный объем хлороформа. 7) Перемешать. 8) ЦФ 5' при 13 тыс.об/мин. 9) Надосадочную жидкость отобрать в чистую пробирку. 10) Доб.0,5 объема 600 мкл. 5 М NaCl. 11) ЦФ 30' 10 тыс. G. 12) Надосадочную жидкость слить в чистую пробирку. 13) Доб.равный объем изопропанола, t= -20°С. 14) Инкубировать 15-20' при -20°С. 15) ЦФ 20' (10') при 10 тыс. G, 4°С. 16) Надосадочную жидкость слить. 17) К осадку доб.300-500 мкл. 75% этилового спирта. 18) ЦФ 10 тыс. G 10' 4°С. 19) Сушить при комн.темп. 20) Ресуспендировать (р-рить осадок) в 50 мкл.дд воды. 21) Агарозный ЭФ.


30. Методы выделения геномной ДНК животных.

Для выделения может быть использованы мышечная, соединительная ткань, печень, волосы, ногти, перья, эпителий, костный порошок и т.д.

Способы выделения ДНК.

Большинство современных методов выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения состоят из следующих этапов: разрушение клеточных стенок (при их наличии); лизис клеточных мембран; очистка от ингибиторов ферментативных реакций (ПЦР, рестрикции).

Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота. Этот этап можно проводить непосредственно в лизис-буфере, используемом для разрушения клеточных мембран.

Лизис клеточных мембран происходит в лизис-буфере: под воздействием поверностно-активных веществ или хоатропных солей происходит разрушение липидного бислоя. В состав лизис-буфера могут входить протеиназа К, разрушающая протеины или РНКаза для удаления РНК (в больших количествах может ингибировать ПЦР и др. ферментативные реакции).

После разрушения клеточных стенок и лизиса мембран образуется мультикомпонентная смесь (раствор), содержащий, в том числе, ДНК.





Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница