Экзаменационные вопросы по дисциплине «Спецпрактикум по клеточной и молекулярной биотехнологии»



страница2/6
Дата17.11.2018
Размер1.3 Mb.
ТипЭкзаменационные вопросы
1   2   3   4   5   6

Выделение ДНК из тканей животных

Данный метод используется для выделения высокомолекулярной ДНК. В основе метода лежит лизис клеток SDS (додецилсульфат натрия, входит в состав многих бытовых моющих средств и зубной пасты), депротеинизация фенолом и хлороформом и осаждение ДНК спиртом.

Необходимые реагенты:

STE-буфер: 0,1М NaCl; 0,1М Tris-HCl (рН 7,5); 0,001M ЭДТА, стерилизовать автоклавированием (20 мин. при 121°С).

PCl: смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт в пропорции 25:24:1. Фенол предварительно перегнать под воду и довести рН до 7,1-7,5 добавлением ТЕ-буфера

Cl: смесь хлороформ-изоамиловый спирт в пропорции 24:1.

ТЕ-буфер: 0,001М Tris-HCl (рН 7,5); 0,001M ЭДТА

Предварительно растереть ткань в жидком азоте в фарфоровой ступке.

1. Перенести 100 мг пробы в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку (Eppendorf), прилить 500 мкл STE-буфера.

2. Добавить 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл рабочего раствора) и 25 мкл SDS (20% водный раствор), ресуспендировать пробу.

3. Инкубировать 1-2 часа при 55°С, периодически переворачивать пробирку для перемешивания пробы.

4. Добавить 500 мкл PCl, перемешивать до образования однородной эмульсии (не допускается энергичное встряхивание во избежание механического разрушения ДНК).

5. Центрифугировать 5 мин при 7000 g.

6. Верхнюю фазу перенести в чистую 1,5 мл пробирку, стараясь не захватывать интерфазу.

7. Повторить ПП. 4-6.

8. Добавить 500 мкл Cl, перемешивать до образования однородной эмульсии (не допускается энергичное встряхивание во избежание механического разрушения ДНК).

9. Центрифугировать 3 мин при 7000 g.

10. Верхнюю фазу перенести в чистую 1,5 мл пробирку, стараясь не захватывать интерфазу.

11. Повторить ПП. 8-10.

12. Добавить 45 мкл 2М NaCl или 3M NaAc и 1 мл 96% этанола, премешать переворачивая пробирку.

13. Инкубировать в морозильной камере при -16 (-20)°С 10-20 минут.

14. Центрифугировать 1-2 мин при 7000 g, супернатант удалить.

15. Просушить осадок от спирта в вакуумной центрифуге или при комнатной температуре (открыв крышку пробирки) до исчезновения запаха спирта (примерно 20 мин.).

16. Растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды или ТЕ-буфера.

Выделение ДНК из крови

Гуанидинизотиоционат является очень сильным денатурирующим агентом, который используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков. В основе метода лежит лизис клеток крови и сорбция молекул ДНК на сорбенте SiO2. После промывки от примесей ДНК смывается с частиц сорбента водой или ТЕ-буфером. Данный подход используется в большинстве отечественных наборов для выделения ДНК из крови. ДНК получается высокой степени очистки и малыми потерями, но сильно фрагментированная. Также частицы SiO2, попавшие в выделенную ДНК могут ингибировать ПЦР.

Необходимые реагенты:

ЛБГ: 120 г гуанинтиоционата растворить в 100 мл 0,1 М Tris-НСl, рН 6,4; добавить 22 мл 0,2 М раствора ЭДТА и 2,6 г Triton Х-100. Раствор гомогенизировать.

ОРГ: 120 г гуанинтиоционата растворяют в 100 мл 0,1 М Tris-НСl, рН 6,4. Растворение ускорить подогреванием до 60-65°C при перемешивании.

ЭБ: Растворить 1,21 г Tris-НСl в 60 мл воды, добавить 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА рН 8,0. Концентрированной соляной кислотой довести рН до 8,0. Довести объем раствора до 1 л.

Автоклавировать при + 121°С в течение 20 минут.

1. В стерильную пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл внести 900 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоционатом (ЛБГ) и 100 мкл крови.

3. Добавить 40 мкл суспензии сорбента SiO2 (перед использованием встряхнуть на вортексе), 5 секунд встряхивать на вортексе.

4. Термостатировать при +56°С в течение 15-30 мин.

5. В течение 5 секунд встряхивать на вортексе, центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин.

6. Супернатант удалить в сосуд с 10 М NaOH (не допускать разбавления щелочи ниже 0,3 М), тем самым нейтрализуя синильную кислоту, образующуюся при контакте гуанидинтиоционата с кислотами.

7. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл отмывающего раствора с гуанидинтиоционатом (ОРГ). Встряхнуть на вортексе.

8. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин.

9. Супернатант удалить сосуд с NaOH.

10. пп. 7-9 повторить еще раз.

11. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл 70% водного раствора этанола. Встряхнуть на вортексе.

12. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин.

13. Супернатант удалить сосуд с NaOH.

14. ПП. 11-13 повторить еще раз.

15. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл ацетона. Встряхнуть на вортексе.

16. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об./мин. Супернатант удалить.

17. После удаления ацетона пробирки с открытыми крышками поместить в термостат на + 56°С.

18. Инкубировать в течение 10 минут.

19. К осадку сорбента добавить 50-75 мкл элюирующего буфера (ЭБ). Встряхнуть на вортексе.




Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница