Экзаменационные вопросы по дисциплине «Спецпрактикум по клеточной и молекулярной биотехнологии»



страница4/6
Дата17.11.2018
Размер1.3 Mb.
ТипЭкзаменационные вопросы
1   2   3   4   5   6

Метод мини-геля. Электрофорез в мини-геле является быстрым и удобным способом измерения количества ДНК с одновременным анализом ее физического состояния.

1.Смешайте 2 мкл пробы ДНК с 3 мкл буфера для нанесения (краситель-оранжевый Ж) и нанесите эту смесь на 0,8% агарозный мини-гель, содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия. 2.Смешайте 2 мкл каждого из серии стандартных растворов ДНК (0,5-50 мкг/мл) в таком же количеством буфера для нанесения. Нанесите пробы на гель. Стандартный раствор ДНК должен содержать ДНК приблизительно такого же размера, какой имеет неизвестная ДНК. 3.Проводите электрофорез до тех пор, пока оранжевый Ж не продвинется приблизительно на 5-6 см. 4.Сравните интенсивности флуоресценции неизвестной и стандартных ДНК в коротковолновом УФ-свете и определите количество ДНК в пробе.



Определение концентрации белка по собственной флуоресценции: Метод основан на способности аром.а/к (Trp, Tyr, Phe) поглощать УФ с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отл.по сод.аром.к/т, их поглощение в УФ обл. спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0. Измеряя оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм, содержание белка рассчитывают с помощью номограммы: экспериментально полученные величины оптической плотности при 260 и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией; точка пересечения этой прямой со шкалой, на которой дана концентрация белка, определяет содержание белка в исследуемом растворе.

Определение концентрации белка методом Лоури. Метод основан на образовании окрашенных продуктов аром.а/к с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Интенсивность окраски комплекса, к-я пропорциональна кол.белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически. Посл-ть работы: а) построение калибровочной кривой для данного в-ва; б) изм.оптической плотности исследуемого р-ра и опр.концентрации в-ва в р-ре по калибровочной кривой.
43. Питательные среды, используемые для выращивания E.coli и агробактерий.

Среда LB (Лурия-Бертрани). На 1 л.: триптон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl – 10 г. Доведите рН до 7,5 с помощью NaOH.

Среда SOB. На 1 л.: триптон – 20 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl – 0,5 г. Доведите рН до 7,5 с помощью КОН и проавтоклавируйте. Непосредственно перед использованием добавьте 20 мл. 1М MgSO4, проавтоклавированного отдельно.

Среда SOC: идентична среде SOB за исключением того, что содержит также 20 мМ глюкозу. После автоклавирования среды SOB ее охлаждают и добавляют 20 мл 1 М стерилизованной фильтрацией глюкозы.


44. Выделение плазмидной ДНК из клеток кишечной палочки.

Принцип метода: На стадии лизиса происходит разрушение геномной ДНК, белков и липидов клеток бактерий, в усл-х, позволяющих сохр.плазмидную ДНК интактной. Далее плазмидная ДНК сорбируется на силиконовом носителе спин-колонки, тогда как примеси разл. прир. отд-ся промыванием. На посл.стадии плазмидная ДНК элюируется с носителя. Необх.оборудование: (центрифуга), Качалка на 37°С с зажимами для универсальных пробирок (например, Gallenkamp). Баня сухой лед/этанол.

Растворы. — NB(ниобий) + селективные антибиотики для используемых штаммов бактерий (по 5 мл в стандартных пробирках). — Лизирующий раствор (очищающий раствор)— Щелочной ДСН (додецилсульфат натрия)— 3 М ацетат натрия, pH 4,8. На 400 мл: Растворяют 98,44 г ацетата натрия (BDH Analar, безводный) в 200 мл Н2О. Доводят pH до 4,8 ледяной уксусной кислотой (BDH Analar), Затем объем водой — до 400 мл, автоклавируют и хранят при комнатной температуре. — ТЭ-буфер, (10 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) (Этилендиаминтетрауксусная кислота) — 2 М ацетат натрия, pH 5,6— Фенол/хлороформ (1:1) — Хлороформ. — Этанол (—20 °С).

Ход работы: 1) Засевают отд-е колонии, несущие предполагаемые рекомбинантные плазмиды, в 5 мл NB, сод-го селективные антибиотики и инкубируют на качалке в теч.ночи при 37 °С. 2) Разливают по 1,5 мл суспензии кл.микроцентрифужные пробирки и собирают кл.ЦФ-ем при 12 000 об/мин 2' 3) Удаляют супернатант и ресуспендируют кл.100 мкл лизирующего р-ра. Оставляют во льду на 5' 4) Доб. 200 мкл щелочного ДСН и осторожно перемешивают до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной и вязкой. Оставляют во льду на 5' 5) Доб.150 мкл 3 М ацетата натрия (pH 4,8) и перевертывают пробирку неск.раз, пока не обр-ся комок ДНК. Оставляют во льду на 10' 6) ЦФ в микроцентрифуге 10' (в рез.должен обр-ся прозрачный надосадок) и переносят супернатант в новую пробирку. 7) Доб.к супернатанту 1 мл холодного (—20 °С) этанола, хорошо перемешивают и помещают в баню сухой лед/этанол на 15' 8) Собирают преципитат путем ЦФ 12 000 об/мин 10' 9) Осторожно сливают супернатант и р-ряют осадок в 100 мкл ТЭ-буфера. 10)Доб.100 мкл смеси фенол/хлороформ, хорошо перемешивают и разделяют фенольную и водную фазы путем ЦФ 10' при 12 000 об/мин. 11) Переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку, доб.100 мкл хлороформа, перемешивают и разделяют две фазы с пом.ЦФ при 12 000 об/мин 2'. 12) Отбирают и выбрасывают нижнюю фазу, сод-ю хлороформ, к оставшемуся супернатанту, доб. 10 мкл 2 М ацетата натрия (pH 5,6). 13) Доб.1 мл холодного (—20 °С) этанола, перемешивают и инкубируют 15' в бане сухой лед/этанол. 14) Собирают преципитат с пом.ЦФ 12 тыс. об/мин 10' и удаляют супернатант. Доб.1 мл 70%-ного этанола и снова ЦФ-т 5'. 15) Сливают надосадок, высушивают ДНК под вакуумом и р-ряют в 50 мкл бидистН2О 16) ЭФ.
45. Нуклеазы. Значение и применение.

Нуклеазы – ферменты, катализирующие гидролиз фосфодиэфирных связей в нуклеиновых к-тах. Нек-рые из них катализируют гидролиз связей между нуклеотидами только в ДНК, другие действуют только в РНК. Третья группа нуклеаз, не проявляющая специфичности к хим. природе углеводного компонента нуклеиновой к-ты, катализирует расщепление фосфодиэфирных связей в ДНК и РНК. Нуклеазы широко распространены в природе, гидролизуют субстраты с образованием 3'- или 5'-фосфоэфирных форм олигонуклеотидов или мононуклеотидов (содержат на конце молекулы остаток фосфорной к-ты, в положении 3' или 5'). По характеру действия на нуклеиновую к-ту нуклеазы делятся на экзо- и эндонуклеазыЭкзонуклеазы осуществляют ступенчатое отщепление мононуклеотидов от конца полинуклеотидной цепи. Эндонуклеазы разрывают внутримол. связи на всем протяжении цепи. К эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы.  Ряд эндонуклеаз деполимеризуют только однонитевые участки полинуклеотидов, нек-рые как одно-, так и двухцепочечные формы нуклеиновых к-т. Среди неспецифичных нуклеаз наиб. изучены нуклеазы Staphylococcus aureus и S1 из микроскопич. грибов Aspergillus oryzae, к-рые являются эндонуклеазами. Нуклеазы снижают вязкость гноя, слизи, оказывают противовоспалительное действие. Они способны задерживать размножение ряда патогенных для человека вирусов, которые, проникая в клетку макроорганизма, теряют свою оболочку, и становятся объектом воздействия (незащищенная нуклеиновая кислота) соотв. ферментов (рибонуклеаза или дезоксирибонуклеаза).


47. Полиакриламидный гель-электрофорез нуклеиновых кислот.

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс. Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля. После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах. Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины. Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели. Необходимое оборудование: 1) источник питания или трансформатор. 2) камера для электрофореза: а. плашка, б. гребешки, в. камера. 3) весы

4) калька для весов 5) мерный цилиндр 500 мл 6) плоскодонная колба 1000 мл 7) плоскодонная колба 500 мл Необходимые реактивы: 1) ТАЕ-буфер (40х, 50х) (Производство Promega) 2) агароза 3) Этидиум бромид – химическое вещество, которое связывается с нуклеиновыми кислотами и дает белое свечение при UV-лучах. 4) краситель 6х Losding dye. Состав 0,025% БФС. 6) 0,025% ксиленцианол 7) 60% глицерин.

Обволакивает и группирует образец, придает ему массу. 5 объемов образца+1 объем краски. БФС (бромфеноловый синий) – нижний краситель, очень быстро движется внутри геля на уровне 200-400 пар оснований. Ксиленцианол – верхний краситель. От 5 тыс.пар оснований и выше. 5) Молекулярный маркер. Смесь веществ, молекулярная масса которых известна. Используется для определения примерной массы исследуемого образца. Gene ruler. Ход работы: 1) Определить объем геля (камеры) 2) Приготовить 1х буфер. 3) Взвешиваем 500 мл агарозы. 4) Помещаем в колбу. 5) Доводим объем до 60 мл 1х буфером. 6) Кипятить в зависимости от готовности – до полного растворнеия агарозы и прозрачного цвета, до полного растворения крупиц. 7) Агароза медленно остывает при комнатной температуре. Помешивать каждые минуту-две. 8) При достижении t=37°C. Добавить 1-3 мкл.этидиум бромида, перемешиваем. 9) Заливаем раствор в камеру (плашку), разгоняем пузыри на края плашки. 10) Вставляем сухие гребешки. 11) Ждем полимеризации геля. 12) Аккуратно и резко вынимаем гребешки. 13) Поворачиваем плашку с гелем в нужной ориентации. 14) Наливаем 1х ТАЕ в камеру до полного погружения геля в буфер. 15) Удаляем пузыри из ячеек. 16) Перемешиваем образцы с краской. 17) Наносим на гель. 18) Подключаем источник питания.19) Выставляем U=50 В. 20) Запускаем аппарат. 21) Через 5 минут поднимаем U=8 В.


48. Полиакриамидный гель-электрофорез белков.

Электрофорез - направленное движение коллоидных частиц или макроионов под действием внешнего электрического поля. Т.к. скорость движения молекул в электрическом поле зависит от их заряда, формы и размера, то электрофорез может быть использован для их разделения. Основные этапы электрофоретического анализа:подготовка буферных растворов и других необходимых компонентов для проведения электрофореза; подготовка носителя (в случае зонального электофореза); подготовка опытного образца, подлежащего разделению, и нанесение его на носитель; наблюдение за процессом электрофореза; детектирование электрофоретических зон;


оценка результатов электрофореза.

Оборудования: камера для электрофореза,источник тока, стекл пластины для заливки геля,спейсеры,заливочный столик.

Реактивы: дист вода,акриламид-бисакриламид,1,5 М трисHCL,10%SDS, 10%ПСА, ТЕМЕД,глицерин, 1%бромистый этидий, Кумаси голубой.


Р-вы

Разделяющая гель=6 мл

Концентр гель=5 мл

акриламид/бисакрил

4 мл

0,67 мл

вода

3,35 мл

3 мл

1,5 М трисHCL

2,5 мл

-

0,5 М трисHCL

-

1,25 мл

SDS

100 мкл

50 мкл

ПСА

100 мкл

50 мкл

ТЕМЕД

10мкл

10 мкл

Сначала заливается раздел гель, затем конц гель сверху.

Анализир р-р белка разв-ся буфером в конц 1 мкг в 1 мкл, помещают на 100 градусов на 2 мин. На лунку наносится по 20 мкл. Электрофорез прояв-ся при пост токе. По достижению краской нижнего участка ток откл-т. Гели на ночь помещ-т в р-р Кумаси,на след отмывают бесцвет-м р-м сост из дист воды +этанол+концу кс к-та=5:4:1. Разделяющие гели окр-ся в синий цвет.


49. Скрининг синих/белых колоний E.coli.

Идентификация клонов, несущих нужные гибридные (рекомбинантные) молекулы ДНК, называется скринингом.

Бело-синий скрининг для определения позитивных бактериальных колоний/клонов.

Бело-синий скрининг – это технология скрининга, которая позволяет определить успешное лигирование в клонировании генов с использованием векторов. Интересующая ДНК лигируется в вектор. Вектор затем трансформируется в компетентные бактериальные клетки. Компетентные клетки выращиваются в присутствии X-gal и IPTG. Если лигирование прошло успешно, бактериальная колония должна быть белой, если нет – синей. Это технология позволяет быстро и легко определять трансформированные клетки.

Маточный раствор IPTG: изопропил тиогалактозид или изопропил бета-D-тиогалактопиранозид.

Сначала используйте 0,1М раствор. 0,238 г.в 10 мл.воды. Стерилизуется фильтрацией, хранится в холодильнике.

Xgal: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-галактопиранозид.

Исп-ся раствор 20 мг/мл. Он должен быть растворен в DMSO (диметилсульфоксид) или диметил формамиде, но не в воде! Должен находиться в масле для защиты от света и храниться в холодильнике. Согласно Маниатису, Xgal раствор не надо стерилизовать.

X-gal часто исп-ся в МБ для определения наличия фермента β-галактозидазы. X-gal один из множества индоксил гликозидов и сложных эфиров, к-е дают нер-римые голубые соединения, сходные с индиго. Эти соед.появляются в рез.ферментативного гидролиза, осуществляемого β-галактозидазой, к-я кодируется геном LacZ лактозного оперона. Необходимый ген вставляется на место гена LacZ. Отсутствие гена LacZ=>отсутствие белка β-галактозидазы=>отсутствие ферментативной реакции гидролиза=>отсут-е голубых соединений=>лигирование прошло успешно.

Сущ.три основных метода: разлитье хим.реактивы по чашкам до их использования, залить IPTG и Xgal в чашки или добавить хим.в-ва в верхний слой агара.

Добавление IPTG и Xgal до заливания агара в чашкеи. Налейте 40 мкл IPTg и 40 мкл Xgal на дно чашек. Затем дайте чашкам высохнуть. Это займет около 30', если агар одно- или двухдневный и неск.часов, если он свежий. Соедините IPTG и Xgal до разлива. После автоклавирования охлаждают до 65°С и ниже, доб.IPTG до конечной конц. 0,1 мМ и Xgal до конечной конц. 40 мкл/мл. Будьте уверены, что добавили селективный антибиотик вовремя: обычно исп-ся ампициллин в конц.100 мкг/мл. Добавьте IPTG и Xgal в агар. Этот метод обычно исп-ся для бактериофагов, но может работать и для бакт.колоний. Используйте 3 мл 0,7% агара (или агарозы, если вы хотите разрезать ДНК рестрикционными ферментами) при 50°С. Добавьте 10 мкл.маточного р-ра IPTG и 40 мкл.маточного р-ра Xgal. Затем добавьте бактерии, быстро перемешайте крутя пробирку между своими ладонями и залейте в чашки Петри.

Отбор правильного вектора и компетентных клеток важны при планировании бело-синего скрининга. Вектор должен содержать альфа-цепь lacZ. Примеры таких векторов:

pUC19, pBluescript. Клетки E.coli должны содержать мутантный ген lacZ.

Некоторые белые колонии могут не содержать желаемого рекомбинантного вектора по ряду причин: лигированная ДНК не совсем правильная, она может быть трансформирована при введении; ее концы были «репарированы» и сшиты вместе, но т.к.LacZ не продуцируется, то и сини колонии не формируются.

Колонии, не содержащие вектор, могут стать белыми после того, как используемый антибиотик был исчерпан. Также возможен вариант, когда синие колонии содержат вставку. Это происходит, когда вставка находится в одной рамке считывания с геном LacZ, в к-й отсутствует стоп-кодон. Это приводит к эспрессии слитого белка, к-й по прежнему ф-ц-т как LacZ.



50. Стадии ПЦР. Значение.

63. Полимеразная цепная реакция. Значение в генной инженерии.

80. ПЦР. Стадии. Реакция. Области применения.

1983 – Карл Мюллис изобрел ПЦР. Исп-е ПЦР методики позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или её фрагмент in vitro увеличивая кол.копий в миллионы раз за неск.часов. ПЦР осущ-ют в амплификаторе с пом.спец-го термостабильного фермента ДНК-полимераза (Taq-полимеразы, Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.), ионов Mg2+, необходимых для работы полимеразы, набора всех четырех н/дов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров. Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Tm=2*(A+T)+4*(G+C)-2[°C]. Верхний предел t°плавления ограничен оптимумом t действия полимеразы, активность к-й падает при t°> 80 °C.

ПЦР протекает в три циклические стадии, к-м предшествует стадия общей денатурации ДНК (5' при t=94°С). Для остановки ПЦР температуру снижают до +4°С, при к-й Taq-полимераза теряет активность.

Циклические стадии:1. Денатурация. Инкубационную смесь, в к-й сод-ся образец нужной ДНК, нагревают до Tm , к-ю высчитывают по формуле, приведенной выше. При этом в течении 0,5-2' происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы обр-ся две одноцепочечные. 2. Аннилинг (гибридизация праймеров, ренатурация, отжиг). Когда цепи разошлись, t° понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. t° аннилинга зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной t° плавления праймеров. Неправильный выбор t° приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной t°), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических прод-в (при заниженной t°). Время стадии отжига30 cек. 3. Полимеризация (синтез, элонгация). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, исп-я праймер в кач.затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, к-ый связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. t° элонгации зависит от полимеразы. Часто исп-емые полимеразы Taq и Pfu наиб. активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. В рез.кол.ДНК удваивается.

После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.



Можно провести 30 и более циклов. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увел-ся экспоненциально. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен кол-м реагентов, присутствием ингибиторов, обр-м побочных прод-в. На посл.циклах р-ции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

ПЦР технологии позволили ученым без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. ПЦР применяют в установлении отцовства, в медицинской диагностике, персонализированной медицине, клонировании ДНК, мутагенезе и т.д.


51. Методы Саузерн-блот гибридизации. Протокол и области применения.

Саузерн блоттинг — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Метод: 1.Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания  ДНК на более мелкие фрагменты 2.Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине 3.В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, н-р, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану 4.В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. 5.Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран). Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченой пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной. После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путем авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания). Результаты: Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе. Применение. Саузерн блоттинг может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, к-я гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями.
52. Метод Вестерн-блот гибридизации. Протокол и области применения.

Вестерн-блоттинг  — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. Подготовка образца. Образец может быть взят из цельной ткани или из клеточной культуры. Для разделения различных клеточных компартментов и органелл применяют комбинации биохимических и механических методик фракционирования, в том числе, различные типы фильтрации и центрифугирования. Различные детергенты, соли и буферы могут быть применены для улучшения лизиса клеток и растворения белков. Ингибиторы протеаз и фосфатаз часто добавляются для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами. Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков ПААГе в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS) по Лэммли. SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей, например, дитиотреитол и меркаптоэтанол. Перенос на мембрану. Белки вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF). Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки. Эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Coomassie blue или Ponceau S. Блокирование. Как только выбрана мембрана за её способность связывать белки, выбраны антитела и целевой белок, должны быть приняты меры по исключению взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка (ибо антитело само по себе белок). Блокирование неспецифичных связываний достигается помещением мембраны в разбавленный раствор белка — обычно бычий сывороточный альбумин с небольшим процентом детергента типа Tween 20 или Triton X-100. Детекция. В силу различных причин, детекция проводится в два этапа. Антитела вырабатывают, воздействуя на класс хозяйских или на культуру иммунных клеток некоторым белком. После блокирования разведенный раствор первичных антител (обычно между 0.5 и 5 мкг/мл) инкубируется с мембраной и слегка встряхивается. Обычно раствор состоит из буферного раствора соли с небольшим процентным содержанием детергента. После полоскания мембраны для удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают в других антителах, напрямую связывающихся с класс-специфическими участками первичных антител. Вторичные антитела обычно связывают с биотином или с репортёрным ферментом (щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена). Это значит, что несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным и усиливать сигнал. Лист светочувствительной фотографической пленки помещается напротив мембраны и подвергается действию излучения реакции, создавая изображение полос антител на блоте. Анализ. После отмывки несвязавшихся меток, вестерн блот готов к детекции зондов, связавшихся с целевым белком. Приблизительный размер вычисляют сравнивая окрашенные бэнды с маркерами молекулярной массы, добавленными при электрофорезе. Процесс повторят с структурными белками (актин или тубулин), которые не меняют между экспериментами. Количество целевого белка зависит от количества контрольного структурного белка между группами. Этот прием обеспечивает коррекцию количества общего белка на мембране в случае ошибки или неполного переноса.
53. Методы Нозерн-блот гибридизации. Протокол и области применения.

Нозерн-блот — метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (мРНК) и их фрагментов в образцах. Основным отличием метода нозерн-блот от Саузерн-блот является то, что определяемым субстратом является не ДНК, а РНК, в качестве зондов используют комплементарные молекулы ДНК. Применяют Нозерн- блот в следующих типах экспериментов: 1.Для определения размера или размеров специфических мРНК, кодируемых данным геном 2.Для выявления того, присутствуют или нет в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет 3.Как много присутствует этой РНК, как изменяется ее количество в развитии данного типа клеток. Осуществляют в следующие этапы: 1)Выделение РНК; 2)Фракционирование РНК в агарозном геле; 3)Перенос молекул РНК из геля на мембрану; 4)Гибридизация с радиоактивно-меченным ДНК-зондом. Визуализация продуктов гибридизации путем авторадиографии. Для денатурации РНК используют глиоксаль/диметилсульфоксид (ДМСО) или формамид/формальдегид. Суммарный препарат РНК первоначально разделяют электрофоретически в геле, а затем переносят на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр. После фиксации РНК на фильтре с помощью УФ-облучения этот фильтр используют для гибридизации с одноцепочечными мечеными зондами. Используя маркеры молекулярного веса можно определить размер транскрипта какого- то гена. Скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последовательности, что позволяет точно определить размер РНК транскрипта. Изготовление Нозерн-блотов с РНК, денатурированной глиоксалем/ДМСО. Материалы: Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК. 1)10 х буфер для электрофореза: 100 мМ фосфат натрия, рН 7,0. 2)Смесь для денатурации: 3 мл 6 М глиоксаля, 7,5 мл ДМСО, 1,5 мл 10 х буфера для электрофореза. 12 мкл смеси для денатурации добавляют к 3 мкл раствора РНК (содержащего до 20 мкг РНК). 3)Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза. 4)Агароза. Методика:1)Денатурируют РНК, выдерживая ее в течение 1 ч в смеси для денатурации при 50 °С. 2)Фракционируют РНК с помощью электрофореза в 1 х буфере для электрофореза. Обычно используют гель длиной 10—15 см, содержащий 1,1% агарозу. 3)Отрезают дорожки, на которые были нанесены маркеры мол. масс, и окрашивают их бромистым этидием в течение 30—60 мин,  4)На УФ-трансиллюминатор рядом с гелем (дорожка с маркером) кладут линейку и фотографируют их. 5)Глиоксилированную РНК переносят из агарозного геля на мембранный фильтр. Фильтр предварительно замачивают в 20 х SSC; этот же буфер применяют для переноса. Процесс обычно занимает 16 ч.  6)По окончании переноса гель вместе с фильтром помещают на лист сухой фильтровальной бумаги гелем вверх и мягким карандашом отмечают положение на фильтре геля и лунок. 7)Снимают гель и окрашивают его бромистым этидием для проверки эффективности переноса.  8)Промывают фильтр несколько раз в 20 х SSC и подравнивают его края. 9)Нитроцеллюлозный фильтр прожаривают при 80 °С в вакууме в течение 2 ч, а нейлоновый облучают УФ-светом в течение 3—5 мин на УФ-трансиллюминаторе. Обработанный таким образом фильтр можно хранить при 4° С; нитроцеллюлозные фильтры необходимо хранить под вакуумом. 10)Важно после переноса промыть фильтр в 20 х SSC для полного удаления всех следов агарозы.
54. Секвенирование методом Максама-Гилберта.

В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченой ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.
55. Секвенирование методом Сэнгера.

Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определённом месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез. Результаты и ошибки сэнгеровского секвенирования

На выходе из сэнгеровского секвенатора получаются короткие участки ДНК, так называемые риды (reads). Для биоинформатики принципиальны две вещи: во-первых, какой длины получаются риды, во-вторых, какие в них могут быть ошибки и как часто. Сэнгеровские риды по этим критериям очень хороши: получаются риды длиной около тысячи нуклеотидов, причём качество начинает заметно падать только после 700-800 нуклеотидов. Сам процесс секвенирования по Сэнгеру, предопределяет и эффект падения качества и другой эффект – если в геноме встречается длинная последовательность из одной и той же буквы (…AAAAAAAA…), трудно бывает точно определить, какой она длины – все промежуточные массы попадут в одну и ту же пробирку, некоторые из них могут не встретиться, некоторые слиться друг с другом и т.д. Но всё же сэнгеровское секвенирование даёт отличные результаты с достаточно длинными ридами, которые потом относительно легко собирать.

Именно при помощи сэнгеровского секвенирования был впервые расшифрован геном человека.


56.Выделение геномной ДНК дрожжей

Известен способ выделения ДНК, включающий использование лизоцима, додецилсульфата натрия, ЭДТА в качестве индукторов лизиса клеточной стенки с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом.

Известно использование литических ферментов (зимолиазы, литиказы и др.) для разрушения клеточных стенок дрожжей при получении образцов высокомолекулярной ДНК.

Известен способ выделения ДНК путем разрушения клеток грамположительных микроорганизмов и дрожжей с помощью 3% SDS.

Все вышеперечисленные способы выделения ДНК достаточно трудоемки, дороги и занимают много времени.

Известен способ выделения геномной ДНК, состоящий в том, что обработку дрожжей проводят буферным раствором, содержащим соль-хаотроп (производные гуанидиния) в концентрации 4-8 М при нагревании реакционной смеси в течение 3-7 мин. Однако он неэффективен в отношении некоторых природных изолятов дрожжей, обладающих очень прочной и плотной клеточной стенкой, практически не пропускающей наружу внутриклеточные белки в ходе экстракции хаотропными растворами.

Пример. Клетки дрожжей S.cerevisiae выращивают в жидкой среде YPD (1% дрожжевого экстракта, 2,0% бактопептона, 2% глюкозы, рН 5,3). 30 мг сырой биомассы клеток дрожжей суспендируют в 400 мл буфера Е и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 7 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают в 1 мл дистиллированной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,5% саркозила и 50 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 1 час при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, а осадок дважды промывают дистиллированной водой (1 мл). Супернатанты после двух промывок водой также сохраняют, а полученный осадок суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.
57. Рентгеноструктурный анализ. Исследования Розалинды Франклин.

Методом изучения геометрического строения молекулы (взаимного расположения центров атомов и углов между связями) является метод рентгеноструктурного анализа кристаллов органических веществ. Он основан на том, что всякое вещество обладает способностью рассеивать падающее на него излучение, в том числе рентгеновское. При этом рассеяние рентгеновских лучей кристаллами находится в определенном соответствии с расположением атомов в кристалле. При падении на кристалл рентгеновских лучей в некоторых направлениях возникают очень интенсивные рассеянные лучи; в этих направлениях молекулы рассеивают лучи в одной фазе. В то же время имеется множество пространственных направлений, в которых рассеянные лучи не усиливают, а гасят друг друга. Соответственно этому рентгенограмма кристалла, т. е. фотоснимок картины рентгеновского рассеяния, состоит из отдельных пятен разной степени почернения. Определяя расстояния между пятнами и величины интенсивностей лучей, можно делать важные заключения о строении вещества. Одним из важнейших вкладов Франклин в модель Уотсона-Крика стала её лекция, проведенная в ноябре 1951 года, где она представила присутствующим, две формы молекулы, типа А и типа В, а также её строение, при котором фосфатные группы расположены с наружной части молекулы. Она также определила количество воды в молекуле и соотношение её в различных частях молекулы - данные, которые были чрезвычайно важны для сохранения стабильности молекулы. Франклин первая открыла и сформулировала те факты, которые впоследствии составили основу для последующих попыток построить модель молекулы. Ещё одним вкладом стала рентгенографический снимок В-ДНК (названный фотографией 51) , который был мельком показан Джеймсу Уотсону Морисом Уилкинсом в январе 1953 года. Морису Уилкинсу фотографию 51 передал аспирант Франклин, Реймонд Госслинг. В мемуарах Уотсона “Двойная спираль” было рассказано о поступке Перутца. Уотсон и Крик получили отчет от Перутца в феврале 1953, спустя короткое время после того, как Уотсон получил снимок 51 ДНК типа “В”, сделанного Франклин. Таким образом, нет сомнения в том, что отчет помог им проанализировать верные данные, полученные Франклин, которые объясняли эту и другие фотографии. В результате всего этого, когда Крик и Уотсон приступили к построению модели в феврале 1953, они работали с параметрами, определенными Франклин в 1951 году. Возможно, Розалинд Франклин никогда и не знала того, что полученные ею результаты были использованы при строительстве модели ДНК, но Морис Уилкинс об этом знал.


58. Трансляция у растений.

Установлено, что у растений и животных в основном функционируют одни и те же механизмы трансляции. Клетки растений обладают дополнительной системой биосинтеза белка, функционирующей в хлоропластах. Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза. Так же как и митохондрии, хлоропласты обладают собственным геномом, представленным множественными копиями кольцевой ковалентно замкнутой ДНК, длина которой составляет ~150 т.п.о. Геном хлоропластов заключает в себе более 100 различных генов. Как и митохондрии, хлоропласты обладают собственной системой транскрипции, репликации и трансляции. В отличие от митохондрий животных, система трансляции хлоропластов высоко гомологична системе бактерий и представлена 70S рибосомами, собственными тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазами, многочисленными факторами трансляции и т.п. Геном хлоропластов содержит гены всех рРНК (16S, 23S и 5S), которые кластеризованы и транскрибируются полицистронно. В большой субчастице рибосом хлоропластов рРНК 23S-типа часто представлена двумя или четырьмя фрагментами. У хлоропластов отсутствует полный набор тРНК, необходимых для декодирования кодонов. Эта проблема решается так же, как и у митохондрий: индивидуальные тРНКPro(UGG), тРНКAla(UGC) и тРНКArg(ACG) распознают по четыре кодона, которые кодируют каждую из аминокислот, акцептируемых соответствующими молекулами тРНК. Генетическая информация хпДНК во многих случаях редактируется на уровне мРНК. В результате запрограммированных замен нуклеотидов в мРНК происходит создание новых инициирующих и терминирующих кодонов. Результатом редактирования предшественника мРНК хлоропластов является создание в результате двух замен нуклеотидов инициирующего и терминирующего кодонов с образованием новой открытой рамки считывания, т.е. фактически нового гена, посттранскрипционно. Мутационные изменения некоторых SD-подобных последовательностей снижают эффективность трансляции мутантных мРНК, что указывает на функциональную значимость этих участков мРНК. Детальное исследование 5'UTR мРНК гена psbA хлоропластов табака позволило идентифицировать цис- действующие регуляторные элементы, существенные для ее трансляции. Два из них - RBS1 (AAG) и RBS2 (UGAU), расположенные между нуклеотидами в положениях -11 и -9, -25 и -22 соответственно комплементарны 3'-концу 16S рРНК хлоропластов. Полагают, что они участвуют во взаимодействии 30S субчастицы рибосом с мРНК. AU-богатая последовательность, расположенная между ними (UAAAUAAA) и получившая название AU-бокса, также критична для трансляции. Как и у бактерий, AUG является основным инициирующим кодоном мРНК хлоропластов и направляет включение в полипептидную цепь формилметионина. Информация о молекулярных механизмах отдельных этапов трансляции в хлоропластах еще не получена. Общая схема трансляции. Инициация.1. Узнавание стартового кодона (AUG), сопровождается присоединением тРНК аминоацилированной метионином (М) и сборкой рибосомы из большой и малой субъединиц. Элонгация.2. Узнавание текущего кодона соответствующей ему аминоацил-тРНК (комплементарное взаимодействие кодона мРНК и антикодона тРНК увеличено). 3. Присоединение аминокислоты, принесённой тРНК, к концу растущей полипептидной цепи. 4. Продвижение рибосомы вдоль матрицы, сопровождающееся высвобождением молекулы тРНК. 5. Аминоацилирование высвободившейся молекулы тРНК соответствующей ей аминоацил-тРНК-синтетазой.
6. Присоединение следующей молекулы аминоацил-тРНК, аналогично стадии (2). 7. Движение рибосомы по молекуле мРНК до стоп-кодона (в данном случае UAG). Терминация. Узнавание рибосомой стоп-кодона сопровождается отсоединением новосинтезированного белка и в некоторых случаях диссоциацией рибосомы.
59. Векторы. Значение в генной инженерии.



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница