Экзаменационные вопросы по дисциплине «Спецпрактикум по клеточной и молекулярной биотехнологии»



страница5/6
Дата17.11.2018
Размер1.3 Mb.
ТипЭкзаменационные вопросы
1   2   3   4   5   6

Вектор — мол.ДНК, исп-емая в ГИ для передачи ген-го материала другой кл. Вектор должен обл.след.св-вами: 1. Способность к автономной репликаций. 2. Наличие сайта, в к-м возможно встраивание желаемого фрагмента ДНК. 3. Наличие одного или нескольких маркерных генов, благодаря к-м кл.-реципиент будет обладать новыми признаками, позволяющими отл.трансформированные кл. Это м.б. селективные гены, которые придают кл-м селективное преимущество (устойчивость к антибиотикам).

Плазмиды – внехромосомные ген-ские элем-ы прокариот, к-е автономно реплицируются в клетке. Плазмида, исп-емая в кач.вектора, должна иметь 3 характеристики: иметь сайт ori(участок инициаций репликаций) для нормальной репликаций ДНК и размножения плазмиды в клетке, доминантный селективный маркер, к-й позволяет отобрать кл., несущую плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК, иметь сайт рестрикции. Плазмидный вектор рBR322 создан на основе плазмиды E.coli. Плазмида рBR322 имеет сайт ori (область, ответственную за репликацию плазмиды), гены устойчивости к антибиотикам ампициллину (Ap′) и тетрациклину (Tc′). В гене TC′ имеется уникальный сайт, разрезаемый рестриктазой Bam HI. В плазмидах можно клонировать фрагменты ДНК размером не более 10 тпн.

Фаговые векторы. Чаще всего создают на базе бактериофага λ, сод-го 2цепочечную линейную мол.ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необх-е для репликации. Исп-т для клон-ия фрагментов ДНК эук. (т.е. более крупных генов) размером до 23 тпн.

Космида – это векторная плазмида, предназначенная для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот (до 45тпн) в клетках E. coli. Термин обозначает, что вектор является плазмидой, внутри которой вставлен cos-участок фага λ , представляющий собой н/дную посл-ть, к-я отвечает за упаковку фаговой ДНК в ее протеиновую капсулу . Космиды созданы искусственно в результате комбинаций плазмид и фага λ. Космида имеет посл-ть ori, позволяющая репликацию в кл, селективный маркер ампициллин и уникальные сайты рестрикций . Челночные векторы. Способны реплицироваться в двух и более организмах-хозяевах. Yep24 имеет посл-ть ori,позволяющую реплецироваться в E.Coli и селекционный маркеры ampR и tetR (E.Coli), а также URA3(контроль биосинтеза урацила для клеток дрожжей), посл-сть специфичную для дрожжей-2m circle, позволяющую реплицироваться автономно в дрожжевой клетке. Искусственные хромосомы дрожжей. Хар-ки: теломеры на каждом конце, центромерные посл-ти(CEN), селекционные маркеры на каждом плече, автономно реплецирующая посл-ть ARS,позволяющие реплицироваться в дрож.кл., рестикционные сайты.Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды. Транспозоны - сегменты ДНК, к-е контр-т собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта ДНК в другой путем вырезания из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. ДНК переносится ферментом транспозазой. Длина: 2-10 тыс.н/дных пар. Перенос генов при пом.транспозонов имеет большие преимущества: происходит с высокой частотой и не влечет значительных перестроек интегрируемой ДНК, можно переносить большие фрагменты ДНК.

Вирусы. При вирусной инфекции кажд. кл.может получить большое число копий чужеродного гена. Например, в ДНК SV40 был встроен ген β-глобина кролика, который экспрессировался в линии клеток обезьяны, зараженных рекомбинантным вирусом: в клетках синтезировались и мРНК гена глобина, и сам белок.
60. Репликация у эукариот.

Репликация ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы ДНК на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Механизмы репликации ДНК прокариот и эукариот существенно различаются в том отношении, что во втором случае синтез ведущей и отстающей цепей ДНК осуществляют разные ДНК-полимеразы (альфа и дельта), тогда как у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III .

Репликация ДНК — ключевое событие в ходе деления клетки. Репликация проходит в три этапа: инициация репликации, элонгация, терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятие репликон. Репликон — это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации. Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности.

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка — место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп можно наблюдать репликационный глазок — участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окруженный более протяженными участками нереплицированной ДНК.

В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК-полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500—5000 — у эукариот.

Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный.
61. Вирусы. Организация генома. Механизмы заражения.

Вирусы – возбудители многих инфекционных заболеваний растений, животных и человека. Вирусы классифицируются по носителям наследственной информации:ДНК-содержащие и РНК-содержащие,по хозяевам: вирусы растений, вирусы грибов, вирусы животных и вирусы прокариот, или бактериофаги.К ДНК-содержащим вирусам относятся: вирусы бактерий – бактериофаги, возбудители многих заболеваний человека и животных: вирусы оспы, герпеса, гепатита В, аденовирусы млекопитающих и человека (вызывают желудочно-кишечные заболевания, ОРВИ, конъюнктивиты), вирусы бородавок человека.. Фаг Т–4 – это один из наиболее сложно организованных вирусов.

Геном вирусов включает:1) Структурные гены, которые кодируют белки и занимают примерно 95 % вирусной хромосомы. 2) Регуляторные последовательности, которые не кодируют белки: промоторы, операторы и терминаторы. 3)Прочие некодирующие участки (сайты), в том числе: участок attP, обеспечивающий интеграцию вирусной хромосомы в хромосому клетки–хозяина; участки cos – липкие концевые участки линейных вирусных хромосом, обеспечивающие замыкание линейной хромосомы в кольцевую форму. Гены, кодирующие рРНК и тРНК, в геноме вирусов обычно отсутствуют. Геном вирусов отличается высокой плотности упаковки информации. К РНК-содержащим вирусам относятся многие вирусы растений, возбудители заболеваний человека и животных: вирус полиомиелита, вирусы гриппа А, В и С, вирусы паротита (свинки), кори, чумы плотоядных животных (чумки), бешенства, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).Вирионы РНК-содержащих вирусов содержат РНК. После проникновения в клетку вирусная РНК становится матрицей для синтеза ДНК и РНК.

Механизм проникновения вируса в клетку обеспечивается рецепторным механизмом: специальные белки капсида «узнают» соответствующие рецепторные белки на поверхности чувствительных к данному вирусу клеток. Так аденовирусы и вирус гриппа проникают и размножаются только в клетках слизистых оболочек верхних дыхательных путей, вирусы гепатита А,В,С – в клетках печени, вирус СПИДа – в клетках Т-лимфоцитов. Однако сущ. вирусы, которые поражают различные ткани и органы: вирус кори – дыхательные пути, кожу и кишечник; вирус оспы – кожу и дыхательные пути,.

Различают высокоафинные рецепторы (первичные) и ко-рецепторы (вторичные) или низкоафинные. Далее происходит пенетрация (проникновение) и депротеиназация (раздевание).


62. Создание геномных библиотек.

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить.

Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.

Клонирование ДНК in vivo. Используя мо, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК). Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Это «метод дробовика», т.к.геном представлен отдельными фрагментами. Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, т.к.они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома. Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Т.о.получают рекомбинантную плазмидную ДНК, к-ю вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.

Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток: фрагменты ДНК образуются в огромном кол. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут сод.только часть гена или же интронные последовательности.


64.Генотипирование. Виды используемых маркеров

Генотипирование - метод, позволяющий, на основе изучения ДНК, комплексно проанализировать уникальный для каждого организма генотип. Маркер - это признак или молекула, которая может быть использована для отслеживания определенного признака или гена у анализируемых генотипов. 1.Биохимические маркеры. Анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. 2. Маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). Способ анализа ПДРФ сводится к обработке ДНК рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Так как рестрицирующие эндонуклеазы имеют строго специфические места расщепления, то генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК и получению продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться. 3. ДНК-фингерпринт позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся последовательностей (мультилокусный анализ). Анализ проводится тем же способом, что и в случае ПДРФ, но в качестве специфического гибридизационного зонда используются минисателлиты (тандемно повторяющиеся последовательностидлиной от 9 до 100 т более п.н.). Отдельные последовательности отличаются друг от друга по общей длине (числу повторов "мотива"), а также по некоторым вариациям в нуклеотидной последовательности "мотива". 4. ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции. Различные модификации метода ПЦР легли в основу создания разнообразных типов ДНК-маркеров. 1)STSs-маркеры (от англ. sequence tagged sites). STSs можно рассматривать как мономорфные ДНК-маркеры, поскольку их используют в экспериментах, где наличие полиморфизма не требуется, н-р, построение физических карт геномов или выявление тестируемых последовательностей в рекомбинантных клонах или генетически модифицированных организмах. 2) EST-маркеры (от англ. "Expressed Sequence Tags") являются одной из разновидностей STSs и представляют собой маркеры к экспрессирующимся последовательностям генома (генам). 3)NotI-STS-маркеры содержат последовательности, примыкающие к сайтам узнавания рестриктазы NotI. 5.ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами,  имеющими множественную локализацию в геноме. Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), при использовании праймеров с искусственно добавленными последовательностями (AFLP - Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR - Inter-simple-sequence-repeats) или транспозоны. 6)Полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs). SNPs (от англ. Single Nucleotide Polymorphism) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели) с частотой редкого аллеля не менее 1% .
66. Лигазы. Лигирование ДНК. Значение и области применения.

В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.

В генной инженерии используются 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.



Рис 2.3 пат Механизм лигирования ДНК T4-ДНК-лигазой

1 - образование промежуточного комплекса фермент Е-AMP; 2 - образование фосфодиэфирной связи.

Реакция лигирования протекает в два этапа ( рис. II.3 ). Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток АМР переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Т4- ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'- концевого фосфата и 3'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК.

Особенности:1) быстродействующая – лигирование липких концов происходит в течение 10 минут при комнатной температуре; 2) фермент активен в буферах для рестриктаз, ПЦР и ОТ-ПЦР (при добавлении АТФ);3)ПЭГ(полиэтиленгликоль) обеспечивает эффективное лигирование тупых концов.

Область применения:1) клонирование продуктов рестрикции; 2)клонирование продуктов ПЦР; 3)) сшивание брешей в двухцепочечных ДНК, РНК или ДНК/РНК гибридах;

Широко применяются для создания рекомбинантных ДНК in vitro,необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК. Ингибиторы: сильно ингибируется NaCl или KCl при концентрациях > 200 мM; инактивируется нагреванием при 65 °С в течение 10 мин или при 70 °С в течение 5 мин.


67. Эндонуклеазы. Рестрикция ДНК. Значение и области применения.

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием молекулы ДНК либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Различают 3 основных класса рестриктаз.

1.Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают опред-ую послед-ть нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК не далеко от этой послед-ти в произвольной точке и само место разреза строго не специально. 2.Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают опред-ую послед-ть и разрезают двойную спираль ДНК в опред-ой фиксированной точке внутри этой послед-ти. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные послед-ти, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. 3.Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную послед-ть и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив опред-ое число н.п. от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. В клетках разных видов бактерий могут содержаться рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Такие рестриктазы называют изошизомерами. Изошизомеры некоторых рестриктаз используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме. Рестриктазы HpaI и HpaII расщепляют неметилированные последовательности GCGC и CCGG соответственно и утрачивают способность к расщеплению, если хотя бы один из остатков цитозина в этих сайтах метилирован.

 Рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4-6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК: 1. Посередине этих участков; 2. С некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую . Такие одноцепочные концы называются «липкими», поскольку они могут слипаться между собой в силу комплементарности.

Примером действия рестриктазы второго приведённого случая является EcoRI, которая узнаёт фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ и режет эту последовательность ДНК ассиметрично, «ступенькой», между нуклеотидами Г и А.



Эндонуклеазы предохраняют бактериальные клетки от проникновения в них чужеродных ДНК (напр., вирусных); они широко используются при определении первичной структуры ДНК, для картирования генов и в генной инженерии, для создания и клонирования гибридных молекул ДНК.В настоящее время рестриктазы с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований и генной инженерии.


68. Регуляторные элементы ДНК (промотор, терминатор).

Регуляторные элементы-участки ДНК или РНК, регулирующие экспрессию генов



Промотор- это участок ДНК, с которым взаимодействует РНК-полимераза,т.е. это участок с которого начинается инициация транскрипций.

Оператор- тот участок ДНК, с которым специфически связывается белок-репрессор или белок-активатор.

Терминатор– последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, находятся на 3'-конце гена.

Эукариоты:

Последовательность ТАТА располагается на расстоянии примерно 25-30 нуклеотидов левее от точки старта транскрипции (-25). Эта последовательность (ТАТАААА) встречается в большинстве эукариотических промоторов. Данная последовательность способствует денатурации двойной спирали, т.к. связи А-Т менее прочные и стабильные, чем связи Г-Ц.

Последовательность ЦААТ локализован в большинстве промоторов генов эукариот примерно на 80 нуклеотидов левее стартовой точки транскрипции (-50-150). \ ЦААТ-бокс оказывает сильное влияние на частоту транскрипции, возможно определяет связывание РНК-полимеразы.

ГЦ-мотивы. Последовательность из 10-15 пар Г-Ц находится на расстоянии 300-400 нуклеотидов левее точки старта транскрипции.

Энхансеры (усилители). Эти элементы удалены от точки начала транскрипции на значительные расстояния (несколько тысяч нуклеотидных пар). Их действие на транскрипцию осуществляется через соответствующие регуляторные белки.

Сайленсоры (глушители). Эти регуляторные элементы располагаются на большом расстоянии от точки начала транскрипции. Они блокируют транскрипцию генов при помощи регуляторных белков.

Прокариоты:

Последовательность Шайна — Дальгарно —пуринбогатая последовательность из шести нуклеотидов AGGAGG ,служит сайтом связывания рибосом на молекуле мРНК прокариот, обычно на расстоянии около 10 нуклеотидов до стартового кодона AUG. Комплементарная последовательность CCUCCU, называемая последовательностью анти-Шайна — Дальгарно, располагается на 3'-конце молекулы 16S рибосомной РНК.

Наиболее консервативными являются -10 (TATAAT) и -35 (TTGACA) элементы, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции и узнаются районами сигма-субъединицы, соответственно. Расстояние между -10 и -35 элементами у большинства промоторов составляет 17-18 нуклеотидов.



ТАТА бокс – это богатая тимином и аденином последовательность

из 6 или 7 пар оснований и расположен на расстоянии примерно 10 нуклеотидов до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция .



ЦААТ(СААТ)-бокс-консерватиный регуляторный элемент(последовательность ГГССААТСТ), расположен на расстоянии примерно 35 нуклеотидов до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция .

Некоторые промоторы содержат дополнительный элемент - динуклеотид TG, - который расположен на один нуклеотид левее -10 элемента и узнается районом 2.5 сигма-субъединицы .


69. Методы определения трансгенных растений.

Трансгенные- те растения, в которых функционирует ген пересаженные из других видов растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Примером последнего могут служить полученные методами генной инженерии сорта растений, обладающих повышенной устойчивостью к засухе.



Методы: 1)ПЦР. ПЦР предусматривает три основных действия:искусственный синтез небольших участков ДНК-праймеров, которые комплементарны участку встроенного в организм гена, способны его химически распознать и специфически с ним связываться.Когда праймеры находят целевую последовательность, запускается быстрая цепная реакция синтеза встроенного участка ДНК. Таким образом, встроенная целевая молекула ДНК копируется миллионы раз (амплифицируется).Амплифицированный продукт можно визуализовать при помощи разных устройств. Если продукт детектируется, это является свидетельством, что в пробе выявлена ДНК генно-модифицированного организма.



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница