Экзаменационные вопросы по дисциплине «Спецпрактикум по клеточной и молекулярной биотехнологии»


) Анализ встроенной ДНК по Саузерну



страница6/6
Дата17.11.2018
Размер1.3 Mb.
ТипЭкзаменационные вопросы
1   2   3   4   5   6

2) Анализ встроенной ДНК по Саузерну. Саузерн-блоттинг позв-т не только обнаружить наличие компл-х посл-й, но и опр-ть размеры гибридизовавшихся фрагментов ДНК. Перед гибридизацией, растительная ДНК подвергается рестрикции тем же ферментом, который вырезает искомый ген из плазмиды. Если этот ген присутствует в растительной ДНК, то он тоже вырезается и, после электрофореза, будет отдельная его фракция. При гибридизации, эта фракция свяжется с радиоактивной меткой – зондом, что и будет убедительным доказательством трансгенности растений.

Пример:использование этого метода для исследования растений, которым перенесен аroА ген, обеспечивающий устойчивость к гербициду глифосату.

Перенесение трансгена позволяют определить: селективный ген, который придаёт устойчивость к определённым веществам (чаще всего — антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда — репортёрный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетовом свете.
70. Понятие компетентности. Получение компетентных клеток кишечной палочки.

Компетентность-способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК. У многих бактерий компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры. Например, культуры стафилококков находятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста.У некоторых бактерий клетки компетентны в любой фазе роста (например, у гонококков и менингококков).Состояние компетентности регулируется множеством генов (у бацилл их не менее 40), которые принято подразделять на ранние и поздние. К ранним относятся гены «настраивающие» (подготавливающие)клетку на приобретение компетентности; к поздним – гены, детерминирующие механизмы связывания и поглощения ДНК, преобразования

(или процессинга) ДНК по ходу поглощения; и наконец, гены, управляющие рекомбинацией трансформирующей ДНК с хромосомой реципиентной клетки.

Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами:

• обладают сниженным уровнем метаболизма;

• более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в попу-

ляции;

• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;



• меньшими размерами, чем некомпетентные;

• изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков ци-

топлазматической мембраны;

• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой

обработке;

Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует естественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli. Для этого их клетки обрабатывают тем или иным способом, индуцируя у них способность к поглощению ДНК. Наибольшую известность приобрел метод индукции компетентности с помощью ионов кальция – кальциевый метод. Клетки бактерий выдерживают в присутствии ионов Са2+ при 0 ºС с последующим кратковременным тепловым воздействием при 37 ºС или 42 ºС. В этих условиях возникает общее состояние компетентности и появляется возможность осуществления хромосомной и плазмидной трансформации.Эффективностьтрансформации повышается при совместном действии ионов Са2+ с ионами Mg2+, Mn2+ или Rb+. Кроме того, эффективность трансформации повышается при увеличении времени инкубирования сионами Ca2+, а также при добавлении диметилсульфоксида.Широко используется также способ индукции компетентности засчет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. Приэтом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмиднойДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации.


71. Элюция ДНК из геля.

Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы

Существуют сорта агарозы, в молекулы которой введены гидроксиэтильные группы. Такая агароза образует гель при 30 °С и плавится при 65 °С, т. е. при температуре более низ­кой, чем температура плавления большинства ДНК. На этих свойствах агарозы основан простой метод извлечения ДНК из гелей .

1. Растворить агарозу в электрофорезном буфере нагреванием при 70 °С. Остудите до 37 °С и добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Раз­

лить агарозу и выдержите гель при 4°С, чтобы он хорошо затвердел.

2. Нанести пробы ДНК и провести электрофорез при 4°С, следя за тем, чтобы гель не расплавился во время разде­ления.

3. Вырезать нужный кусочек геля и залить пятью объемами 20 мМ трис-НС1 , pH 8,0, 1 мМ ЭДТА.

4. Прогрть смесь при 65 °С 5 мин, чтобы расплавить гель.

5. Экстрагировать пробу с расплавленным гелем равным объемом фенола при комнатной температуре. Собрать водную фазу после центрифугирования при 20 °С и снова экстрагировать ее вначале смесью фенол — хлороформ, а затем хлороформом.

6. Осадить ДНК этанолом. Обычно ДНК получается достаточно чистой и может служить субстратом для рестриктаз, лигаз и других ферментов.

Электроэлюирование в диализные трубки:

1. Провести разделение в геле и установить местоположение интересующей вас полосы.

2. Вырезать кусок агарозы, в котором располагается полоса.

3. Сфотографировать гель после вырезания полосы, чтобы получить документальное свидетельство того, что будет элюирована нужная полоса.

4. Заполнить диализную трубку доверху буфером ТВЕ (0,5Х). Кусок геля нанести

в трубку.

5. После того как кусок геля опустится на дно трубки, удалите большую часть буфера, оставив его ровно столько, чтобы он закрывал гель.

6. Погрузить трубку в электрофорезную кювету, заполненную буфером ТВЕ (0,5 X). Включите электрический ток (обычно 100 В) на 2—3 ч. За это время ДНК выходит из геля и локализуется на внутренней стенке диализной трубки.

7. Сменить направление тока на 2 мин, чтобы ДНК со стенок диализной трубки перешла в раствор.

8. Открыть трубку и тщательно собрать весь имеющийся в ней буфер. Промойте трубку небольшим объемом буфера ТВЕ (0,5Х).

9. Поместите кусок геля на 30 >мин <в буфер ТВЕ (0,5Х), содержащий бромистый этидий (0,5 мкг/мл). Просмотрите гель в ультрафиолете и убедитесь, что ДНК элюировалась полностью.

10. Очистка элюированного ДНК (хроматографией на ДЭАЭ-сефацеле или прямой экстракцией).


72. Иммуно-ферментный анализ.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Иммуноферментный анализ используется в двух целях: при необходимости определить наличие антигенов возбудителя какой-либо инфекции, либо (что практикуется гораздо чаще) для установления присутствия антител класса IgA, IgM, IgG к антигену возбудителя болезни.

Принцип иммуноферментного анализа базируется на иммунной реакции антигена с антителами, когда, присоединяя к антителам ферментную метку, исследователь определяет результаты реакции антитело-антиген, фиксируя появление, либо изменение уровня ферментативной активности.

Первая реакция наблюдается между очищенным антигеном возбудителей (Ag) и устанавливаемым Ig (Ab) путем фиксирования к плоскости лунок планшета иммунолога.

Вторая иммунологическая реакция проводится с целью выявления появившихся иммунных комплексов. В роли антигена здесь используют специфический связавшийся Ig, антителами же к нему применяют коньюгат – Ig (Ab) к определенному Ig человека, который метят ферментом К (пероксидазой). В качестве субстрата реакции применяют не имеющее цвета вещество под названием хромоген, в процессе реакции хромоген приобретает окраску. По завершению реакции проводится фотометрирование лунки, учет результатов ведут при помощи специального прибора. Математическая обработка результатов исследования показывает наличие и количество характерных антител в пробе.При внесении исследуемой сыворотки в ячейки планшета к антигену прикрепляются гомологичные ему антитела. Затем в ячейки помещают меченные ферментом антитела против антител (иммуноглобулинов) человека. Добавленный после промывки хромоген (краситель) позволит зафиксировать реакцию по характерному окрашиванию ячеек. Интенсивность такой окраски будет пропорциональна доле фермента, и, соответственно – количеству антител.

Современная венерология применяет методику иммуноферментного анализа, диагностируя сифилис, вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекции.





73. Получение поликлональных антител.

Поликлональные антитела — антитела, образующиеся в сыворотке крови в разных клонах B-лимфоцитов и связываются с различными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулы-мишени (антигена).Смесь антител, выделенную из сыворотки крови, называют поликлональным препаратом. Поликлональные антитела получают из сыворотки крови иммунизированного животного, обычно кролика, барана или козы.



Схема получения поликлональных антител иммунизацией кроликов белковым антигеном.

1. Подготовка антигена: для иммунизации нужен чистый препарат белка. Для усиления иммунного ответа и одновременного увеличения чистоты белка применяется иммунизация суспензией полиакриламидного геля с нужным белком после электрофореза. Для этого заливают нужный вид электрофореза, но гребенку делаете сплошной (без зубцов). Наносят белок (обычно на 1 иммунизацию одного кролика требуется не меньше 100 мкг) После электрофореза отрезают узкие боковые края геля и прокрашивают в них искомый белок, затем прикладывают края к оставшейся части геля и вырезаете полосу с основным количеством белка. Эту полоску геля делите на равные части для каждой иммунизации .

2. Иммунизация кроликов. Для иммунизации корректно брать 2, а лучше 3 кроликов поскольку иммунный ответ может сильно отличаться. Кусочек геля с белком измельчают в гомогенизаторе с физ. Раствором,измельчать нужно тщательно, чтобы суспензия геля была однородной и не застряла в игле при иммунизации. К суспензии добавляют полный адъювант Фрейнда. Суспензию вводят кроликам внутрикожно иглой в парапозвоночную область.

3. Забор крови. Кровь берут из ушной вены. Для проверки ответа достаточно взять 0,5-1 мл крови: для этого внешний край уха кролика выбривают пережимают пальцами вену у основания внешнего края уха, в набухшую вену вводят иглу шприца и собирают 0,5-1 мл крови. Если ответ устраивает то через 10-12 суток после иммунизации из ушной вены у животных забирают кровь. В ухо кролика кладут ватный тампон (сначала кусочек ватки смачивают в ксилоле, а затем оборачивают вторым слоем ваты). Через несколько минут вены на разогретом ксилолом ухе набухают и тампон можно убрать. После набухания вены ее надрезают острым лезвием в верхней части уха вдоль вены. Подставляют центрифужный стакан и собирают кровь. Нормально брать 30-50 мл крови от кролика,кровь можно брать 3 раза в неделю. После забора крови ухо тщательно протирают спиртом (остужает ухо и убирает следы ксилола).

Иммунизация кусочками геля усиливает ответ и способствует постепенному освобождению белка из геля в очаге.


74. Диагностика вирусов растений.

Применяют следующие методы диагностики вирусных заболеваний и вызывающих их вирусов: 1) установление инфекционности заболевания; 2) серологический метод; 3) метод растений-индикаторов; 4) электронная микроскопия; 5) метод внутриклеточных включений; 6) метод люминесцентного анализа; 7) анатомический метод; 8) химический метод. Основными из них являются первые четыре метода.

Метод диагностики вирусов при помощи растений-индикаторов:

Метод растений-индикаторов основан на способности различных видов растений реагировать на заражение тем или иным вирусом специфическими видимыми симптомами. Многие из них реагируют на вирусы системным заражением, то есть вирус свободно передвигается по всему растению, вызывая видимые симптомы. Таким индикатором на вирусы X и Y служит, например, табак Nicotiana tabacum. При заражении соком больных растений картофеля молодых растений табака, через 15-25 дней на листьях табака появляется резкое посветление жилок в случае наличия Y-вируса или крапчатость при наличии вируса Х. При внедрении вируса в ткань растения и его размножении происходит локализация места синтеза вирусных частиц путем быстрого отмирания клеток и образования некроза. К числу таких растений-индикаторов относятся Gomphrena globosa – на Х-вирус, гибрид Аквила х Solanum demissum (A-6) – Y- и А-вирусы, S. chacoense (TЕ-1) - на Y-вирус и некоторые другие.



Установление инфекционности заболевания. Все вирусные заболевания заразны, инфекционны. В зависимости от вида вируса как причины заболевания и его свойств для установления инфекционности применяют следующие способы заражения растений.

Инокуляция соком больного растения. Этот метод пригоден для передачи на здоровые растения только тех вирусов, которые могут распространяться контактно-механическим способом.Для приготовления сока используют листья больных растений с четкими симптомами заболевания.

Передача вирусной инфекции прививками. Больной привой прививают на здоровый подвой или наоборот.Передача вирусов с помощью насекомыхпереносчиков. Используют виды насекомых, являющиеся наиболее вероятными переносчиками вируса, чаще всего персиковую тлю (Myzodes persicae).

Серологический метод:

Реакция между антигеном и специфическими антителами, содержащимися в сыворотке, носит название серологической реакции.

На предметное стекло наносят две капли испытуемого сока. Сок выжимают из листьев . В одну из этих капель добавляют одну-две капли сыворотки, специфичной по отношению к тому вирусу, на присутствие которого в растении хотят провести анализ, а в другую такое же количество так называемой нормальной, или контрольной, сыворотки, полученной от животного, не подвергавшегося введению каких бы то ни было антигенов . Капли сока и сыворотки перемешивают Если в соке испытуемого растения содержится вирус, соответствующий антителам, содержащимся в сыворотке, то через 1—3 мин в капле образуются видимые невооруженным глазом хлопьевидные сгустки, или осадок — преципитат (положительная реакция).
75. РНК-интерференция.

РНК-интерференция — биологический механизм управления активностью генов посредством коротких двухцепочечных РНК и специальных белковых комплексов, приводящий к селективной деградации определенных мРНК или ингибированию трансляции многих мРНК в клетке. Механизм РНК-интерференции состоит в том, что присутствующая в клетке двухцепочечная РНК, которая часто представляет собой чужеродный геном РНК-вирусов, разрезается на короткие фрагменты ферментом Dicer. Одна из двух цепей РНК-фрагмента включается в белковый комплекс RISC (RNA-induced silencing complex) и взаимодействует с комплементарной вирусной мРНК, которая затем расщепляется RISC комплексом. В результате синтез белка, кодируемого данной мРНК, прекращается. Наряду с ответом на чужеродную РНК, клетки синтезируют собственные короткие интерферирующие РНК (short interfering RNA — siRNA) из так называемой микроРНК (miRNA). МикроРНК процессируются аналогично двухцепочечным РНК вирусов и подавляют синтез клеточных белков за счет деградации мРНК либо путем создания препятствий на мРНК для работы белок-синтезирующей молекулярной машины (рибосомы). Таким образом, микроРНК являются частью клеточной системы управления активностью генов.

Dicer - АТФ-азная рибонуклеаза - инициатор сайленсинга, разрезает исходную dsRNA1, для матрицы. Имеется геликазный домен, С-концевой сегмент связывания с РНК и РНКазныйIII. Мышиный Dicer М=215 кДа и длиной 1373 аминокислоты расположен на конце 12 хромосомы и экспрессируется в различные фазы развития от эмбриональной

до взрослого состояния. Человеческий Dicer имеет массу 218 кДа.

RISC - мультибелковый комплекс ~500кДа, состоящий из нуклеиновых кислот и белков.


dsRNA1 проникшая в клетку узнается Dicer при помощи вспомогательных факторов RDE-1, RDE-4 и разрезается на фрагменты ~20 пн. siRNAs44. Фрагменты связываются с белковым комплексом RISC, который узнает и разрезает мРНК. Оставшийся одноцепочечный фрагмент может связываться с мРНК и служить затравкой для РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), которая достраивает мРНК до двухцепочечного

состояния, которое вновь узнается белком Dicer. И так происходит до тех пор, пока вся чужеродная мРНК не уничтожится.


76. Транскрипция in vitro.

Транскрипция in vitro-искусственная транскрипция в бесклеточной системе с использованием очищенной молекулы ДНК в качестве матрицы; метод используется для изучения механизмов транскрипции у про- и эукариот.



Синтез РНК из плазмиды in vitro под контролем промотера Т-фага.

Перчатки должны быть надеты все время. Все растворы должны быть без РНКаз.

Необх.реактивы: 100mM DTT, ингибитор рибонуклеазы, T7 или Т3 РНК-полимераза, 2.5mM rNTPs, 5 x T7/T3 буфер для РНК полимеразы (200mM Tris.Cl pH 8.0, 125mM NaCl, 40mM MgCl2, 10mM spermidine), ДНКаза I, свободная от РНКаз. автоклавированный DEPC (диэтилпирокарбонат)-обработанный TE-буфер, бидист.вода

1) линеаризация плазмиды на или вблизи конца вставки кДНК с пом.соответствующей рестрикционной эндонуклеазы

2) Извлечение плазмидной ДНК равным объемом смеси фенол / хлороформ и равным объемом хлороформа перед осаждением этанолом

3) линеаризованную плазмидную ДНК ресуспендируют в автоклавированном, обработанном DEPC TE-буфере, рH=7,5, при концентрации примерно 200нг/мкл. перед использованием. 4) Стандартные условия реакции: 2 мкл.(400 нг) плазмидной ДНК;

20 ед.ингибитора рибонуклеазы; 

2 мкл. 100 мМ DTT; 

4 мкл. 5 х буфера для T3/T7 РНК-полимеразы; 

4мкл. 2.5mM NTPs

Стерильной водой с добавлением DEPC доводят до конечного объема 19.5мкл. 

25ед. (0.5мкл.) T3/T7 РНК-полимеразы

Реакционную смесь инкубируют 37 ° С в теч.60 минут.

5) ДНК-матрицы удаляются путем добавления 25ед.ДНКазы I, свободной от РНКаз и дальнейшей инкубации в течение 30 минут при 37 ° С.

Реакционную смесь дважды экстрагируют смесью фенол/хлороформ, осаждают этанолом, сушат в вакууме и ресуспендируют в 25 мкл стерильном, DEPC-обработанном ТЕ-буфере, рН=7,5.

6) РНК анализируют ЭФ, исп-я денатурирующие усл.в агароза-формальдегид гель системе.


77. Трансляция in vitro.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы используются для изучения матричной активности иРНК и анализа транслируемых с них полипептидов. В их состав входят: рибосомы, матрица (искусственная или природная РНК), белковые факторы трансляции, аминоацил т-РНК, АТФ, одновалентные и двухвалентные катионы (K, Ca), буферный раствор для поддержания гомеостаза, аминокислоты. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, и на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам. По происхождению компонентов бесклеточные белок синтезирующие системы можно классифицировать как прокариотические и эукариотические. Наиболее распространенные прокариотические белоксинтезирующие системы - на основе экстрактов из E.coli. Прокариотическая, как и любая другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3) аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5) одновалентные (К+ или NH4+) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, а также буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических пределах. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.Из эукариотических белоксинтезирующих систем для трансляции матриц эукариот применяют 2 основные системы: из ретикулоцитов кролика и из зародышей пшеницы. Для проведения анализа готовят реакционную смесь, состоящую из ретикулоцитного лизата или экстракта зародышей и смеси аминокислот, меченых аминокислот, АТФ, буфера, матричной РНК и других компонентов. Смесь инкубируют, после чего проверяют включение метки во вновь синтезированные белки (по радиоактивности) и тестируют белки с помощью электрофореза.Трансляция in vitro полезна при уточнении роли отдельных компонентов системы синтеза белка, так как их можно удалять и добавлять по мере необходимости. Ее использование помогает при расшифровке генетического кода. В качестве матричной РНК также используются искусственные полинуклеотиды известного состава.


78. Хроматография. Аффинная, жидкостная и газовая.

В основе хр-фии лежит исп-ние специальных нерастворимых матриц-сорбентов, способных связывать различные в-ва из р-ра. Принцип разделения состоит в том, что разные в-ва из сложных биол-х смесей имеют разное сродство к этому нерастворимому сорбенту. При промывании такой матрицы растворителем в-ва с низким сродством к сорбенту будут вымываться первыми, с более высоким – вторыми и т. д.



Аффинная хр-фия (хр-фия по сродству). Основана аффинная хр-фия на принципе избирательного взаимодействия белков (или др. макромолекул) с закрепленными на носителе специфическими вми—лигандами, кот-ми могут быть субстраты или коферменты, антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (котм заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осущ-ют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи м\у белками и лигандами. Достоинством метода яв-ся возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты.

Жидкостная хр-фия — это хр-фия, в кот-й подвижной фазой яв-ся жидкость.

Неподвижной фазой м. б. твердый сорбент, твердый носитель с нанесенной на его пов-сть жидкостью или гель. Различают колоночную жидкостную хр-фию, в кот-й ч\з колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси в-в в потоке элюента (под давлением или под д-ем силы тяжести), и тонкослойную жидкостную хр-фию, в кот-й элюент перемещается под д-ем капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлич. фольгу, вдоль пористой полимерной пленки, по пов-сти цилиндрич. кварцевой или керамич. палочки, по полоске хроматографич. бумаги. Разработан также метод тонкослойной жидкостной хр-фии под давлением (элюент прокачивают ч\з слой сорбента, зажатого м\у пластинами). Жидкостная хр-фия прим-ся как аналитическая и препаративная. В высокоэффективной жидкостной хр-фии (ВЭЖХ) исп-ют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (3-10 мкм); давление для прокачивания элюента до 3.107 Па (ее называют также хр-фией высокого давления). Варианты ВЭЖХ -микроколоночная хр-фия на наполненных колонках малого диаметра и капиллярная хр-фия на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. К жидкостной хр-фии обычно относят также гидродинамич. хр-фию, где неподвижная фаза отсутствует. В этом случае исп-ют тот факт, что скорость потока элюента максимальна в центре полого капилляра и минимальна у его стенок, а разделяемые компоненты распределяются м\у движущимися с разной скоростью слоями элюента в соответствии со своими размерами или под влиянием наложенного в поперечном направлении внеш. силового поля (центробежного, электрического, магнитного).



Газовая хр-фия — разновидность хр-фии, метод разделения летучих компонентов, при кот-м подвижной фазой служит инертный газ (газ-носитель), протекающий ч\з неподвижную фазу с большой поверхностью. В кач-ве подвижной фазы исп-ют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газ-носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми в-ми.

Различают газо-твёрдофазную и газо-жидкостную хр-фию. В первом случае неподвижной фазой яв-ся твёрдый носитель (силикагель, уголь, оксид алюминия), во втором — жидкость, нанесённая на поверхность инертного носителя.

Газо-жидкостная хр-фия — разделение газовой смеси вследствие различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности образующихся комплексов. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной — газ.

Разделение основано на различиях в летучести и растворимости (или адсорбируемости) компонентов разделяемой смеси.

Этот метод можно исп-ть для анализа газообразных, жидких и твёрдых в-в с молекулярной массой меньше 400, кот-е должны удовлетворять определённым требованиям, главные из кот-х — летучесть, термостабильность, инертность, лёгкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют органические в-ва, поэтому газовую хр-фию широко исп-ют как серийный метод анализа орг-х соед-й.
79. Получение рекомбинантных белков. Продуценты и этапы.

Рекомбинантный белок-белок, синтезированный в клетке из ДНК с искусственно введенными последовательностями генов, кодирующих белок. Рекомбинантные белки получены с помощью генной инженерии, методом рекомбинантных ДНК. Путем помещения генов человека, животных или растений в генетический материал клеток бактерий, млекопитающих или дрожжей, эти микроорганизмы могут использоваться как продуценты белков для медицинских, научных и исследовательских целей.

Общий метод получения рекомбинантного белка:молекулярное клонирование гена или его фрагмента;трансформация клеток, отбор клонов;выращивание культуры или организма;выделение и очистка белка.

Схема получения рекомбинантного инсулина:

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется

предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин

состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных

остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и

проинсулин переходит в активный инсулин.

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.

2 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются,

образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи.

6. этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают



инсулин.




Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница