Контроль качества образцов биоматериала пациентов



Скачать 152.01 Kb.
Дата21.01.2018
Размер152.01 Kb.
#9897






Институт химической биологии и фундаментальной медицины

СО РАН

Стр. из 8

Контроль качества образцов биоматериала пациентов

СОП-ЛФ-4.ККБ-001

Дата введения документа:

«_____»_____________201 г.



Действительно до:

«_____»_____________201 г.



Версия № 1

Копия №







Должность

ФИО

Подпись

Дата

Утвердил:

заведующий лабораторией фармакогеномики

Филипенко М.Л.







Составил (изменил):

м.н.с. лаборатории фармакогеномики

Соколова Е.А.










СОП-ЛФ-ККБ-001

Контроль качества образцов биоматериала

  1. Введение, цель

Настоящая методика устанавливает порядок контроля качества образцов биоматериала пациентов (ДНК, РНК и плазма), депонированных в КБМЗ ИХБФМ СО РАН.

  1. Назначение

Проверка качества образца КБМЗ ИХБФМ СО РАН является основным этапом поддержания Коллекции биоматериалов (ДНК, РНК и плазма) пациентов, страдающих мультифакторными социально-значимыми заболеваниями в рабочем состоянии. Проверка качества образца производится в момент депонирования в КБМЗ ИХБФМ СО РАН и перед включением образца в исследование.

Настоящая СОП предназначена для сотрудников лаборатории фармакогеномики ИХБФМ СО РАН.



  1. Термины и определения

СОП – стандартная операционная процедура;

КБМЗ - Коллекция биоматериалов (ДНК, РНК и плазма) пациентов, страдающих мультифакторными социально-значимыми заболеваниями;

ПЦР – полимеразная цепная реакция;

Оператор – сотрудник лаборатории, в должностные обязанности которого входит проведение и обеспечение работ по выделению нуклеиновых кислот из плазмы.

  1. Пересмотр

Данная СОП вводится впервые.

  1. Материалы и оборудование

    1. Материалы и реактивы

Наименование основных реактивов и материалов

НТД, производитель, страна

Колба 250 мл из термостойкого стекла

ГОСТ 1770-74, Россия

Ультрамикронаконечники 0,5-10 мкл, универсальные, Maxymum Recovery

Axygen Scientific Inc., США

Наконечники до 1000 мкл (от 100 мкл), голубые, 100 шт./штатив

Axygen Scientific Inc., США

Пробирки типа Eppendorf 1.5 мл

Axygen Scientific Inc., США

Мерные цилиндры вместимость 50 мл, 500 мл, 1000 мл, 2000 мл

ГОСТ 1770-74

Штатив для пробирок 1,5-2 мл, на 80 мест

Хеликон, Россия

Штатив-подставка для пипеток универсальный на 5 дозаторов

Хеликон, Россия

Пипетки вместимостью 1÷10 мкл

«Ленпипет», Россия

Пипетки вместимостью 100÷1000 мкл

«Ленпипет», Россия

Хирургический скальпель

Тумботино, Россия

Клейкая лента канцелярская Attache прозрачная 19 мм х 33 м (пластиковая втулка)

Attache, Россия

Маркер перманентный Paper Mate SHARPIE TWIN TIP, 1 мм

Paper Mate, США


Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Пакеты полипропиленовые одноразовые с индикаторами стерилизации, для сбора и термической обработки (дезинфекции и утилизации) медико-биологических отходов

АБРИС+, РФ

Дистиллированная вода качества MQ-вода

ГОСТ 6709-72

Агароза для электофореза

Sigma, США

Трисгидроксиметиламинометан (Tris-base)

Sigma, США

ЭДТА

Sigma, США

Ацетат натрия, осч

Sigma, США

Концентрированная (ледяная) уксусная кислота

ГОСТ 61-75

Маркер длин 1 т.п.н.

Биосан, Россия

Бромистый этидий

Sigma, США




    1. Оборудование

Оборудование

НТД, производитель, страна

Спектрофотометр

NanoDrop™ Lite Spectrophotometer , Thermo Scientific™, США

Термостат Thermo-Shaker TS-100C

BioSan, Латвия

Прецизионные лабораторные весы KERN 572

Kern & Sohn, Германия

Камера для горизонтального электрофореза SE-2

Хеликон, Россия

Источник питания, 5-400 В, 5-400 мА, 0,5-80 Вт, 2 выхода, Эльф-4

ДНК-Технология, Россия

Электроприбор лабораторный немедицинского назначения: гель-документирующее устройство, модель: GelDoc XR

BioRad, США

Персональный компьютер с программным обеспечением для гель-документирующего устройства модели: GelDoc XR

ASUS, Тайвань

Спектрофотометр

Ultrospec 500 pro Visible spectrophotometer, Amersham Biosciences, Великобритания

Автоклавная установка

ЗАО «Тюменьский завод медицинского оборудования и инструментов», РФ



    1. Комплект спецодежды

Одежда

НТД, производитель, страна

Колпак медицинский

ГОСТ 2313478

Перчатки хирургические резиновые

ГОСТ 3-88

Маска медицинская

ГОСТ EN 13795-1-2011

Халат медицинский

ГОСТ 24760-81



  1. Помещения

Проведение работ осуществляется в помещениях лаборатории фармакогеномики ИХБФМ СО РАН.

  1. Процедура

    1. Подготовительный этап

7.1.1. Подготовка персонала к проведению работ

– надеть медицинский халат и перчатки, колпак и маску перед началом работ.



7.1.2. Приготовление концентрированного буфера ТАЕ (20×)

– взвесить 108,8 г ацетата натрия трехводного, 193,6 г Tris-base, 14,88 г ЭДТА;

- растворить в 1,5 л в MQ-воде, довести pH до 8.0 ледяной уксусной кислотой и довести объем раствора в мерном цилинде до 2 л.

7.1.3. Приготовление рабочего буфера ТАЕ

– влить в мерный цилиндр 50 мл концентрированного ТАЕ и довести MQ-водой до 1000 мл, закрыть фольгой, перемешать, проавтоклавировать 40 минут.



7.1.3. Приготовление 1%-ного агарозного геля для ДНК

– взвесить (1±0,1) г агарозы и пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла;

– добавить 100 мл рабочего электрофорезного буфера, перемешать и расплавить в СВЧ-печи до полного растворения агарозы;

– остудить до температуры 65 – 70 °С;

– добавить 5 мкл раствора бромистого этидия 10 мкг/мл;

– поместить плашку для заливки геля на заливочный столик, установленный горизонтально. Выровнять столик для заливки геля. Вставить гребенку в плашку, закрепить гребенку и залить расплавленный охлажденный до температуры 65 – 70 ºС гель в плашку толщиной 0,6 см. Если образовались пузыри, их необходимо удалить;

– вынуть гребенку из геля после полного застывания, не повредив карманы;

– аккуратно вырезать гель из плашки с помощью скальпеля;

– поместить гель в камеру для горизонтального электрофореза;

– залить в камеру рабочий раствор буфера в таком количестве, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху;

– промыть карманы пипетированием, не касаясь дна, аккуратно. Убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в них.

7.1.4. Приготовление 1,5%-ного агарозного геля для РНК

– взвесить (1,5±0,1) г агарозы и пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла;

– добавить 100 мл рабочего электрофорезного буфера, перемешать и расплавить в СВЧ-печи до полного растворения агарозы;

– остудить до температуры 65 – 70 °С;

– добавить 5 мкл раствора бромистого этидия 10 мкг/мл;

– поместить плашку для заливки геля на заливочный столик, установленный горизонтально. Выровнять столик для заливки геля. Вставить гребенку в плашку, закрепить гребенку и залить расплавленный охлажденный до температуры 65 – 70 ºС гель в плашку толщиной 0,6 см. Если образовались пузыри, их необходимо удалить;

– вынуть гребенку из геля после полного застывания, не повредив карманы;

– аккуратно вырезать гель из плашки с помощью скальпеля;

– поместить гель в камеру для горизонтального электрофореза;

– залить в камеру рабочий раствор буфера в таком количестве, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху;

– промыть карманы пипетированием, не касаясь дна, аккуратно. Убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в них.

7.1.5. Приготовление дезинфицирующего раствора

– приготовить 3% раствор перекиси водорода, в стеклянный цилиндр налить (100±1) мл 30% перекиси водорода и довести объем до 1000 мл водопроводной водой, данный раствор может быть использован в течение 48 ч.



7.2. Основной этап

7.2.1. Подготовка персонала к проведению работ

– надеть боксовый халат, перчатки, шапочку и медицинскую маску.



7.2.2. Оценка сохранности кодировки образца биоматериала

– визуально оценить сохранность надписи с кодом образца биоматериала на пробирке. В случае деформации надписи или закрывающего ее скотча оператор обязан перенести образец в новую пробирку, указать на ней код образца маркером, заклеить надпись клейкой лентой. Если надпись нечитаемая, то оператор обязан утилизовать образец.



7.2.3. Оценка количества биоматериала (ДНК, РНК) в образце

7.2.3.1 Оценка количества ДНК в образце спектрофотометрическим методом

– образец ДНК предварительно разморозить в термостате;

– включить прибор NanoDrop™ Lite Spectrophotometer;

– выбрать программу «dsDNA»;

– провести считывание «фона»: а) промыть датчик прибора нанесением 3 мкл дистиллированной воды, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой, б) нанести 2 мкл дистиллированной воды на датчик прибора, провести измерение Blank, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой, в) еще раз нанести 2 мкл дистиллированной воды на датчик прибора, провести второе измерение Blank, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой, г) если считывание «фона» прошло успешно, то прибор выведет на дисплей сообщение «Blank confirmed», д) если считывание «фона» не выполнено, то повторить пункты а)-в) еще раз.

– нанести на датчик 2 мкл образца ДНК, провести измерение, зафиксировать письменно величины: коэффициент A260/280, концентрацию ДНК в нг/мкл;

– промыть датчик нанесением 2 мкл дистиллированной воды, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой;

– повторить измерение. Нанести на датчик 2 мкл образца ДНК, провести измерение, зафиксировать письменно величины: коэффициент A260/280, концентрацию ДНК в нг/мкл;

– промыть датчик нанесением 2 мкл дистиллированной воды, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой;

– выключить прибор;

– после оценки количества ДНК в образце спектрофотометрическим методом провести определение чистоты и размера молекул ДНК в образце методом агарозного гель-электрофореза.

7.2.3.2 Оценка количества РНК в образце спектрофотометрическим методом

– образец РНК предварительно разморозить в термостате;

– включить прибор NanoDrop™ Lite Spectrophotometer;

– выбрать программу «RNA»;

– провести считывание «фона»: а) промыть датчик прибора нанесением 3 мкл дистиллированной воды, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой, б) нанести 2 мкл дистиллированной воды на датчик прибора, провести измерение Blank, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой, в) еще раз нанести 2 мкл дистиллированной воды на датчик прибора, провести второе измерение Blank, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой, г) если считывание «фона» прошло успешно, то прибор выведет на дисплей сообщение «Blank confirmed», д) если считывание «фона» не выполнено, то повторить пункты а)-в) еще раз.

– нанести на датчик 2 мкл образца РНК, провести измерение, зафиксировать письменно величины: коэффициент A260/280, концентрацию РНК в нг/мкл;

– промыть датчик нанесением 2 мкл дистиллированной воды, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой;

– повторить измерение. Нанести на датчик 2 мкл образца РНК, провести измерение, зафиксировать письменно величины: коэффициент A260/280, концентрацию РНК в нг/мкл;

– промыть датчик нанесением 2 мкл дистиллированной воды, затем промокнуть насухо фильтровальной бумагой;

– выключить прибор;

– после оценки количества ДНК в образце спектрофотометрическим методом провести определение чистоты и размера молекул ДНК в образце методом агарозного гель-электрофореза.

7.2.4. Определение чистоты биоматериала (ДНК, РНК) в образце и размера молекул ДНК, РНК методом агарозного гель-электрофореза

7.2.4.1 Определение чистоты и размера молекул ДНК в образце методом агарозного гель-электрофореза

– образец ДНК предварительно разморозить в термостате;

– залить агарозный гель согласно п. 7.1.3;

– внести в каждую лунку 1%-ного агарозного геля по 1 мкл образца ДНК. В отдельные карманы внести маркер молекулярных масс в каждом ряду дорожек;

– подключить камеру к источнику постоянного электрического тока. Выставить параметры источника. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 6-10 В/см;

– выключить источник тока после завершения электорофореза, отсоединить провода от источника тока, перенести гель на трансиллюминатор гельдокументирующего устройства;

– задокументировать полученную картину распределения длин ДНК в агарозном геле после проведения электрофореза при помощи трансиллюминатора;

– после определения чистоты и размера молекул ДНК в образце методом агарозного гель-электрофореза вернуть образец ДНК в место хранения до непосредственного начала исследования.



7.2.4.2 Определение чистоты и размера молекул РНК в образце методом агарозного гель-электрофореза

– образец РНК предварительно разморозить на льду;

– залить агарозный гель согласно п. 7.1.3;

– внести в каждую лунку 1.5%-ного агарозного геля по 3 мкл образца РНК. В отдельные карманы внести маркер молекулярных масс в каждом ряду дорожек;

– подключить отдельную камеру (исключительно для гель-электрофореза образцов РНК) к источнику постоянного электрического тока. Выставить параметры источника. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 3-5 В/см;

– выключить источник тока после завершения электорофореза, отсоединить провода от источника тока, перенести гель на трансиллюминатор гельдокументирующего устройства;

– задокументировать полученную картину распределения длин ДНК в агарозном геле после проведения электрофореза при помощи трансиллюминатора;

– после определения чистоты и размера молекул ДНК в образце методом агарозного гель-электрофореза вернуть образец ДНК в место хранения до непосредственного начала исследования.



7.2.5. Оценка гемолиза в образце плазмы пациента

– образец плазмы предварительно разморозить на льду;

– включить прибор Ultrospec 500 pro Visible spectrophotometer;

– перенести аликовту образца плазмы в кювету и провести измерение на длине волны 400 нм;

– задокументировать полученные значения;

7.3. Завершающий этап

– обработать 3% раствором перекиси водорода поверхности помещения и оборудования после окончания работ;

– обработать помещение ультрафиолетовыми лучами после окончания работ в течение 15 мин;

– инактивацию и уничтожение биообразцов и контейнеров проводят автоклавированием в пакетах для дезинфекции и утилизации медико-биологических отходов. После автоклавирования пакеты выбрасывают как бытовые отходы.



  1. Охрана труда и техника безопасности

При проведении процедуры необходимо соблюдать следующие инструкции по технике безопасности и инструкции по биобезопасности:

  1. ИОТ – 02 Инструкция по ОТ для неэлектротехнического персонала по электробезопасности на I квалификационную группу;

  2. ИОТ – 10 Инструкция по ОТ при работе с облучателем бактерицидным ОБНП 2(2х15-01) «Генерис»;

  3. ИОТ – 34 Инструкция по ОТ при работе с ЛВЖ в лабораториях института;

  4. ИОТ – 72 Инструкция по ОТ при работе с перекисью водорода и органическими перекисными соединениями;

  5. ИОТ – 86 Инструкция о мерах ПБ в лабораториях;

  6. ИОТ – 99 Правила работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности и возбудителями паразитарных болезней.

Список ознакомления




ФИО

Должность

Дата

Подпись исполнителя

Подпись руководителя

1

2

3

4

5

6




































































































































































































































































































______________________________________________________________________

Данный документ конфиденциальный и без подписей недействителен





Каталог: lib -> exe -> fetch.php
fetch.php -> Памятка по настройке
fetch.php -> Конспект урока на тему "защита информации"
fetch.php -> Лекции «Коллекция биоматериалов (днк, рнк и плазма) пациентов, страдающих мультифакторными социально-значимыми заболеваниями»
fetch.php -> Древний славянский музыкальный инструмент. Седой старец, с длинной бородой и в белых одеждах, играющий на гуслях это символ дохристианской, языческой культуры
fetch.php -> «Основы пробоподготовки для анализа на автоматических генных анализаторах фирмы Applied Biosystems»

Скачать 152.01 Kb.

Поделитесь с Вашими друзьями:




База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница