Полная исследовательская публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно действующей интернет-конференции «Бутлеровские чтения»



Скачать 128.81 Kb.
Дата09.08.2019
Размер128.81 Kb.
#127563
ТипИсследование

Тематический раздел: Биохимические исследования. Полная исследовательская публикация

Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно

действующей интернет-конференции «Бутлеровские чтения». http://butlerov.com/readings/

Поступила в редакцию УДК 577.151.04 577.344 615.849.19

© Исследование механизмов фотомодуляции митохондриальной цитохром с оксидазы при действии низкодозового синего (450 нм) облучения.

Донцов1 Александр Евгеньевич, Сережникова1,2+ Наталья Борисовна, Воспельникова3 Наталья Дмитриевна, Левин1 Петр Петрович, Зак1 Павел Павлович

1 ФГБУН Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН,



ул. Косыгина, 4, г. Москва, 119334, Россия.

Тел.: 8(499)135-78-94 E-mail: ibcp@sky.chph.ras.ru



2 ФГБОУВО Московский государственный университет имени М.Ю. Ломоносова,

Ленинские горы, д. 1, стр. 12, г. Москва, 119192, Россия.

Тел.:8(495)939-27-76 E-mail: info@mail.bio.msu.ru



3ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, кафедра биологической химии,

ул. Трубецкая, д.8, стр. 2, г. Москва, 119991, Россия



Тел.:8(499)248-05-53 E-mail: rectorat@sechenov.ru

____________________________________



+ Поддерживающий переписку

Ключевые слова: японский перепел, митохондрии, цитохром с оксидаза, LED облучение, синий свет.

Аннотация

Цель работы – исследование механизмов фотобиомодулирующего действия светодиодного облучения на митохондриальную активность. Установлено, что облучение митохондрий печени японского перепела Coturnix japonica синим LED светом (450 нм) или красным LED светом (630 нм) в дозах 0.5 - 2.5 Дж/см2 приводит к 12% повышению уровня цитохром с оксидазной активности. Получены спектральные характеристики эмиссии и возбуждения флуоресценции суспензии митохондрий. Предположено, что наиболее вероятными мишенями облучения, приводящими к модулирующему действию на цитохром с оксидазу, являются протопорфирины и ФАД-зависимые дегидрогеназы дыхательной цепи митохондрий. Предложена возможная схема модулирующего действия света на митохондриальную активность.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 15-29-03865.

+ e-mail: natalia.serj@yandex.ru

Введение

В настоящее время хорошо установлены факты благоприятного воздействия на ткани и клетки организма облучения лазерными и светодиодными источниками света в длинноволновом диапазоне (фотобиомодуляция). Так, например, было показано, что фотобиомодуляция оказывает лечебное действие, улучшая зрительные параметры при таких заболеваниях глаза как свето-индуцированная ретинальная дегенерация [1, 2], возрастная макулярная дегенерация [3-5], пигментный ретинит [6, 7], диабетическая ретинопатия [8, 9]. Фотобиомодуляцию проводят, как правило, в далеком красном или ближнем инфракрасном диапазонах спектра, поскольку, как хорошо известно, более коротковолновое облучение может оказывать токсическое действие на клетки [10]. Мы недавно показали, однако, что LED облучение клеток ретинального пигментного эпителия глаза японского перепела Coturnix japonica синим светом (450 нм), осуществляемое при небольших энергетических экспозициях (≤ 1 Дж/см2), оказывает благотворное воздействие на эти клетки [11, 12].

Конкретные механизмы и молекулярные мишени фотобиомодуляции полностью не выяснены. Положительные эффекты фотобиомодуляции на клетки могут быть связаны с активацией самых различных фоточувствительных молекул. В настоящее время общепринято, что благоприятное воздействие фотобиомодуляции на клетки связано с улучшением работы их митохондриального аппарата [13, 14]. Дыхательная цепь митохондрий содержит значительное количество различных фоточувствительных молекул, поглощающих свет от синего до дальнего красного диапазона. Но первичным акцептором для фотобиомодуляции принято считать цитохром с оксидазу – терминальный фермент дыхательной цепи, катализирующий реакцию восстановления кислорода до воды [13-16]. Активация цитохром с оксидазы приводит к повышению митохондриального мембранного потенциала, повышению уровня внутриклеточного АТФ, изменению редокс-состояния клеточной цитоплазмы [13, 15]. Цитохром с оксидаза представляет собой большой многокомпонентный ферментный комплекс, содержащий два медных центра (CuA и CuB) и два центра содержащие протопорфирины, связанные с атомом железа в Fe2+ форме – гемы а и а3. Электроны переходят последовательно от цитохрома с к CuA, затем к гему а, а от него к гему а3- CuB и окончательно к молекулярному кислороду [14, 15, 17].

Хорошо известен феномен прямого фотовосстановления цитохром с оксидазы светом с различными длинами волн [18, 19]. Цитохром с оксидаза может также восстанавливаться различными донорами электронов, включая пероксиды [20]. Эти процессы могут лежать в основе фотомодулирующего действия света на митохондрии. Так показано, что облучение красным светом очищенной митохондриальной цитохром с оксидазы приводит к увеличению начальной скорости реакции, превышающей на 10-20% исходный темновой уровень [21], в то время как облучение коротковолновым светом (≤ 400 нм) или видимым светом в высоких дозах (≥ 10 Дж/см2) суспензии митохондрий приводит к их повреждению, в частности, к потере дыхательного контроля и энергетического сопряжения [22, 23]. Однако работ, по влиянию низкодозового коротковолнового синего облучения на активность дыхательной цепи митохондрий практически нет. Такие работы могут пролить свет на возможность применения синего света для модуляции митохондриальной активности и управления метаболическими процессами в клетке. Цель настоящей работы – исследование спектров флуоресценции суспензии митохондрий печени японского перепела, а также выяснение влияния низких доз синего облучения на активность митохондриальной цитохром с оксидазы.



Экспериментальная часть

Работа выполнена на митохондриях печени птиц японского перепела Coturnix japonica. Эвтаназию птиц производили методом декапитации в соответствии с европейской директивой 2010/63/EU. В соответствии с Заключением комиссии по биоэтики ИБХФ РАН (протокол №1/15 от 19 декабря 2017 г.) работа была выполнена с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Митохондрии были изолированы из измельченной и гомогенизированной печени перепела путем дифференциального центрифугирования по стандартной методике с небольшими модификациями [24]. Среда выделения содержала 0.25 М сахарозу, 10 мМ гидроксиэтилперазин-этансульфоновую кислоту (HEPES), 1 мМ ЭДТА, рН 7.4. Полученные митохондрии суспендировали в минимальном объеме 0.1 М К-фосфатного буфера, рН 7.4, так, чтобы концентрация белка составляла 35-45 мг/мл и использовали в день выделения. Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом.

Спектры электронного поглощения регистрировали на спектрофотометре UV-1700, “Shimadzu”, Япония. Спектры эмиссии и возбуждения флуоресценции регистрировали на спектрофлуорофотометре RF-5301PC, “Shimadzu”, Япония.

Цитохром с оксидазную активность измеряли, используя в качестве окисляемого субстрата проникающий краситель тетраметил-p-фенилендиамин (ТМФД) в восстановленной форме [25]. Реакционная среда содержала 0.25 М сахарозу, 10 мМ (HEPES), рН 7.4, 5 мкМ ротенон, 0.4-0.8 мМ ТМФД, 5 мМ MgSO4 и 0.3-0.5 мг/мл митохондриального белка. Эксперимент ставился следующим образом – пробу, содержащую все необходимые ингредиенты, кроме красителя, разделяли на две равноценные, одна из которых стояла в темноте (контроль), а другая облучалась (опыт). Инкубацию проводили при постоянном перемешивании при комнатной температуре. После окончания облучения к обеим пробам сразу же добавляли одинаковое количество красителя и измеряли кинетику окисления спектрофотометрически при длине волны 612 нм.

Экспозиция клеток при синем и красном облучении. Суспензию митохондрий печени японского перепела облучали синим (450 нм) и красным (630 нм) светодиодными (LED) источниками света. Энергия синего облучения не превышала 3.0 Дж/см2. Время облучения, как правило, не превышало 15 минут. Облучение проводили при комнатной температуре. Контрольными образцами служили пробы, содержащиеся в темноте.
Результаты и их обсуждение
В экспериментах опытные образцы суспензии митохондрий подвергали облучению синим светом с различными величинами энергетической экспозиции, после чего регистрировали кинетику окисления ТМФД против контроля, не подвергавшегося облучению (рис. 1).


Рис. 1. Стимуляция активности цитохром с оксидазы при облучении

митохондрий синим (2) и красным светом (3). Столбик 1 – темновой

контроль
Показано, что при относительно низких дозах (от 0.5 Дж/см2 до примерно 2.5 Дж/см2) синее светодиодное облучение вызывает небольшую, но достоверную стимуляцию реакции окисления (столбик 1 - темновой контроль и 2 – облучение синим светом). В среднем по всем измерениям (8) стимуляция окисления ТМФД митохондриальной цитохром с оксидазой при облучении синим светом со средней энергетической экспозицией равной 1.8 Дж/см2 составила (12±5) %. Этот результат показывает, что синий свет в таких экспозициях не только не угнетает фермент, но и стимулирует его активность. Стимуляция этого процесса красным светодиодным облучением (630 нм) была примерно на том же уровне и не превышала 10-20% (столбик 3). Однако при облучении красным светом вплоть до энергетических экспозиций 10 Дж/см2 мы не наблюдали ингибирования этого процесса.

С целью выяснения возможных молекулярных мишеней для действия света на митохондрии в настоящей работе были изучены спектры электронного поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции суспензий митохондрий в 0.1 М фосфатном буфере. Спектры электронного поглощения представляют из себя бесструктурную полосу, тянущуюся в видимую область вплоть до ближней ИК (рис.2).




Рис. 2. Абсорбционный спектр суспензии митохондрий печени японского

перепела


В области 280 нм наблюдается хорошо выраженное белковое плечо, а в области около 430 нм наблюдается слабо выраженное плечо, обусловленное, по-видимому, поглощением полосы Соре порфиринового фрагмента цитохром с оксидазы.

Спектры флуоресценции суспензии митохондрий содержат интенсивную полосу около 520 нм (рис. 3, кривая 2). Спектр возбуждения этой флуоресценции характеризуется полосой при 450 нм (рис. 3, кривая 1).





Рис. 3. Основные полосы в спектре флуоресценции (кривая 2, при возбуждении

450 нм) и возбуждения флуоресценции (кривая 1, эмиссия при 520 нм)

Аналогичные полосы наблюдались в других флуоресцентных исследованиях различных тканей и были отнесены к флуоресценции флавинов (флавинмононуклеотида и флавинадениндинуклеотида [26, 27].

Использование очень чувствительной флуоресцентной методики позволяет также регистрировать в митохондриях печени перепела наличие небольших количеств протопорфирина. В длинноволновой части спектра флуоресценции митохондрий наблюдаются слабые характерные полосы испускания из первого электронно-возбужденного состояния протопорфирина, расположенные в красной области около 600-800 нм (рис. 4) [26 - 28].





Рис. 4. Слабые полосы в длинноволновой части спектра флуоресценции (кривая 2,

при возбуждении 450 нм) и возбуждения флуоресценции (кривая 1, эмиссия

при 750 нм) митохондрий, обусловленные наличием протопорфиринов
Данная флуоресценция широко используется для диагностики различных клеточных структур. Наличие протопорфирина в клетках, дающего при фотовозбуждении помимо флуоресценции метастабильное триплетное состояние, способное генерировать активные формы кислорода, инициировало развитие ряда методик фотодинамической терапии в онкологии [28 - 30].

Cпектр возбуждения флуоресценции протопорфирина в митохондриях (рис. 4) соответствует спектру электронного поглощения протопорфирина - наблюдается полоса в голубой области около 450 нм, что соответствует длинноволновому краю поглощения Соре, а также в красной области поглощения Q полос при 550 – 650 нм.

Известно, что флавинадениндинуклеотид (ФАД) при фотовозбуждении образует реакционноспособное триплетное состояние (3ФАД), которое способно эффективно отрывать электрон и атом водорода от соответствующих доноров с образованием свободных радикалов [28]. Тушение 3ФАД молекулярным кислородом генерирует синглетный кислород, а радикал ФАД реагирует с кислородом путем переноса электрона с образованием супероксидного радикала.

Фотовозбуждение митохондрий как в голубой области спектра, так и в красной приводит к одному и тому же результату - образованию фотоактивного нижнего электронно-возбужденного состояния протопорфирина, которое, по-видимому, во многом ответственно за модулирующее действие облучения на дыхательную цепь митохондрий. Кроме этого, облучение в области 450 нм приводит к фотовозбуждению ФАД, который активно участвует в транспорте электронов по митохондриальной дыхательной цепи. Это, по-видимому, может оказывает дополнительное, или даже основное, фотомодулирующее действие. Возможная схема фотомодуляции в дыхательной цепи митохондрий приведена на рис. 5.




Рис. 5. Гипотетическая схема механизмов модулирующего действия LED

облучения на митохондриальную активность

В этой схеме основными мишенями видимого света являются ФАД-зависимые ферменты дыхательный цепи, а также железо и медь-содержащие комплексы цитохромов а и а3. Супероксид, вероятно, является одним из интермедиатов процесса восстановления кислорода в каталитическом цикле цитохром с оксидазы [31], формируя железо-пероксидный комплекс, который в дальнейшем подвергается двуэлектронному восстановлению с образованием двух молекул воды (т.н. пероксидазная фаза реакции цитохром с окисдазы) [32]. Эти процессы могут способствовать процессу модуляции митохондриальной активности.

Выводы

Впервые показано, что облучение митохондрий низкодозовым синим LED светом (450 нм) вызывает ускорение процесса окисления ТМФД в цитохром с оксидазной реакции. Показано, что спектр флуоресценции и возбуждения флуоресценции суспензии митохондрий японского перепела соответствует спектрам флавинадениндинуклеотида. Спектральные характеристики флуоресценции митохондрий японского перепела в длинноволновой области спектра указывают на присутствие протопорфиринов. Предполагается участие суперокисдных радикалов в процессах фотомодуляции дыхательной цепи митохондрий.



Литература

[1] Albarracin R., Eells J., Valter K. Photobiomodulation protects the retina from light-induced photoreceptor degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011. Vol.52. No.6. P.3582-3592.

[2] Qu C., Cao W., Fan Y., Lin Y. Near-infrared light protect the photoreceptor from light-induced damage in rats. Adv. Exp. Med. Biol. 2010. Vol.664. P.365-374.

[3] Begum R., Powner M.B., Hudson N., Hogg C., Jeffery G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS ONE. 2013. Vol.8. No.2. P. e57828.

[4] Ivandic B.T., Ivandic T. Low-level laser therapy improves vision in patients with age-related macular degeneration. Photomedicine and Laser Surgery. 2008. Vol.26. P.241-245.

[5] Merry G.F. Munk M.R., Dotson R.S., Walker M.G., Devenyi R.G.. Photobiomodulation reduces drusen volume and improves visual acuity and contrast sensitivity in dry age-related macular degeneration. Acta Ophthalmol. 2017. Vol.95. No.4. P.e270-277.

[6] Kirk D.K., Gopalakrishnan S., Schmitt H., Abroe B., Stoehr M., Dubis A. Photobiomodulation reduces photoreceptor death and regulates cytoprotection in early states of P23H retinal dystrophy. Mechanisms for low-light therapy. SPIE BIOS. 2013; Vol.8569. P.1-9.

[7] Ivandic B.T., Ivandic T. Low-level laser therapy improves vision in a patient with retinitis pigmentosa. Photomedicine and Laser Surgery. 2014. Vol.32. P.181-184.

[8] Tang J., Du Y., Lee C.A., Talahalli R., Eells J.T., Kern T.S. Low-intensity far-red light inhibits early lesions that contribute to diabetic retinopathy: in vivo and in vitro. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2013. Vol. 54. P.3681-3690.

[9] Tang J., Herda A.A., Kern T.S. Photobiomodulation in the treatment of patients with non-center-involving diabetic macular oedema. British Journal of Ophthalmology. 2014. Vol.98. No.8. P.1013-1015.

[10] Wu J., Seregard S., Algvere P.V. Photochemical damage of the retina. Surv. Ophthalmol. 2006. Vol. 51. P.461-481.

[11] Донцов А.Е., Зак П.П., Сережникова Н.Б., Погодина Л.С., Гурьева Т.С., Дадашева О.А. Активационное действие низкодозового синего облучения на внутриклеточный метаболизм ретинального пигментного эпителия японского перепела Coturnix japonica. В кн.: Материалы II Российского конгресса с международным участием «Пролиферативный синдром в биологии и медицине». М. 2016. C.78-82.

[12] Донцов А.Е., Воробьев И.А., Зольникова И.В., Погодина Л.С., Поташникова Д.М., Сережникова Н.Б., Зак П.П. Фотобиомодулирующее действие низкодозового светодиодного облучения синего диапазона (450 нм) на митохондриальную активность. Сенсорные Системы. 2017. Т.31. №4. С.311-320.

[13] Кару Т.Й. Универсальный клеточный механизм лазерной биостимуляции: фотоактивация фермента дыхательной цепи цитохром-с-оксидазы. В кн.: Современные лазерно-информационные и лазерные технологии. Сборник трудов ИПЛИТ РАН. М. 2005. С.131-143.

[14] Hamblin M.R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem. Photobiol. 2018. Vol.94. P.199-212.

[15] Karu T. Primary and secondary mechanisms of action of visible to near-Ir radiation on cells. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1999. Vol.49. No.1. C.1-17.

[16] Karu T.I., Pyatibrat L.V., Kolyakov S.F., Afanasyeva N.I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2005. Vol.81. P.98-106.

[17] Beirne K., Rozanowska M., Votruba M. Photostimulation of mitochondria as a treatment for retinal neurodegeneration. Mitochondrion. 2017. Vol.36. P.85-95.

[18] Matysik, J. and Alia (2001) The photophysics and photochemistry of cytochrome-c oxidase. Biophysical Processes in Living Systems (Edited by P. Sardhi), Science Publishers, Inc., Enfield, NH. 2001. P.227-244.

[19] Winterle J.S. and Einarsdottir O. Photoreactions of Cytochrome c Oxidase. Photochem. Photobiol. 2006. Vol.82. P.71 1-719.

[20] Matysik J., Hildebrandt P., Ludwig B. Induction of photochemical auto-reduction of cytochrome c oxidase by an organic peroxide. Biochim. Biophys. Acia. 2000. Vol.1459. P.125-130.

[21] Pastore D., Greco M., Passarella S. Specific helium-neon laser sensitivity of the purified cytochrome c oxidase. International Journal of Radiation Biology. 2000. Vol.76. No.6. P.863-870.

[22] Ninnemann H., Butler W.L., Epel B.L. Inhibition of respiration and destruction of cytochrome a3 by light in mitochondria and cytochrome oxidase from beef heart. Biochim. Biophys. Acta. 1970. Vol.205. No.3. P.507-512.

[23] Salet C., Passarella S., Quagliariello E. Effect of selective irradiation on mammalian mitochondria. Photochem. Photobiol. 1987. Vol.45. No.3. P.433-438.

[24] Мосолова И.М., Горская А.И., Шольц И.Ф. Выделение интактных митохондрий из печени крыс. Методы современной биохимии. М.: Наука. 1975. C.45-47.

[25] Papa S., Guerrieri F., Izzo G., Boffoli D. Mechanism of proton translocation associated to oxidation of N-tetramethyl-p-phenylenediamine in rat liver mitochondria. FEBS Let. 1983. Vol.157. No.1. P.15-20.

[26] Plavskii V.Yu, A.V. Mikulich, A.I. Tretyakova, I.A. Leusenka, L.G. Plavskaya, O.A. Kazyuchits, I.I. Dobysh, T.P. Krasnenkova. Porphyrins and flavins as endogenous acceptors of optical radiation of blue spectral region determining photoinactivation of microbial cells. J. of Photochem. Photobiol., B: Biology. 2018. Vol.83. P.172–183.

[27] Li B.H., Zhang Z.X., Xie S.S., Chen R. Fluorescence spectral characteristics of human blood and its endogenous fluorophores. Spectroscopy and spectral analysis. 2006. Vol.26. No.7. P.1310-1313.

[28] Wang W., Tabu K., Hagiya Y., Sugiyama Y., Kokubu Y., Murota Y., Ogura S., Taga T. Enhancement of 5-aminolevulinic acid-based fluorescence detection of side population-defined glioma stem cells by iron chelation. Scientific Reports. 2017. Vol.7. No.42070. P.1-12.

[29] Zhu H., Fan J., Du J., Peng X. Fluorescent Probes for Sensing and Imaging within Specific Cellular Organelles. Acc. Chem. Res. 2016. Vol.49. P.2115−2126.

[30] Croce A.C., Ferrigno A., Bottiroli G., Vairetti M. Autofluorescence-based optical biopsy: An effective diagnostic tool in hepatology. Liver International. 2018. Vol.38. No.7. P.1160-1174.

[31] Hematian S., Garcia-Bosch I., Karlin K.D. Synthetic Heme/Copper Assemblies: Toward an Understanding of Cytochrome c Oxidase Interactions with Dioxygen and Nitrogen Oxides. Acc Chem Res. 2015. Vol.48. No.8. P.2462–2474.

[32] Vygodina T.V., Konstantinov A.A. Peroxidase activity of mitochondrial cytochrome c oxidase. Biochemistry (Moscow). 2007. Vol.72. No.10. P.1056-1064.

Investigation of the mechanisms of photomodulation of mitochondrial cytochrome c oxidase under the action of low-dose blue light (450 nm) irradiation.

Dontsov1 Alexander Evgenievich, Serezhnikova1,2 + Natalia Borisovna, Vospelnikova3 Natalia Dmitrievna, Levin1 Petr Petrovich, Zak1 Pavel Pavlovich

1N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics RAS,

ul. Kosygina, 4, Moscow, 119334, Russia.

Phone: 8(499)135-78-94 E-mail: ibcp@sky.chph.ras.ru

2M.Yu. Lomonosov Moscow State University,

Leninsky Hills, 1, building 12, Moscow, 119192, Russia.

Phone:8(495)939-27-76 E-mail: info@mail.bio.msu.ru

3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Health Ministry of Russian Federation,

Department of biological chemistry,

ul. Trubetskaya, 8, Moscow,119991, Russia

Phone:8(499)248-05-53 E-mail: rectorat@sechenov.ru

Key words: Japanese quail, mitochondria, cytochrome with oxidase, LED irradiation, blue light.

Abstract

The aim of this work is to study the mechanisms of photobiomodulating action of LED irradiation on mitochondrial activity. It has been established that irradiation of mitochondria of the liver of Japanese quail Coturnix japonica with blue LED light (450 nm) or red LED light (630 nm) at doses of 0.5-2.5 J/cm2 leads to a 12% increase in the level of cytochrome с oxidase activity. Spectral characteristics of emission and excitation of fluorescence of a mitochondrial suspension are obtained. It has been suggested that protoporphyrins and FAD-dependent dehydrogenases of the mitochondrial respiratory chain are the most likely targets of irradiation leading to a modulating effect on cytochrome с oxidase. A possible scheme of the modulating effect of light on mitochondrial activity is proposed.

The work was carried out with the financial support of the RFBR grant No. 15-29-03865.

Графическое резюме



Донцов А.Е., Сережникова Н.Б., Воспельникова Н.Д., Левин П.П. и Зак П.П. Исследование механизмов фотомодуляции митохондриальной цитохром с оксидазы при действии низкодозового синего (450 нм) облучения.



Ключевые слова: японский перепел, митохондрии, цитохром с оксидаза, LED облучение, синий свет.

Тип публикации: полная исследовательская

публикация

Регистрационный код:
Страницы:
Каталог: files -> reports -> 2005 -> vol7

Скачать 128.81 Kb.

Поделитесь с Вашими друзьями:




База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница