Руководство оператора


Дыхательная цепь Открытие дыхательной цепи



страница3/6
Дата17.11.2018
Размер0.68 Mb.
ТипКурсовая
1   2   3   4   5   6

Дыхательная цепь




Открытие дыхательной цепи

Началом изучения дыхания принято считать классические опыты А. Лавуазье, который еще в 1777 году показал, что “чистый воздух, войдя в легкие, выходит из них частично в виде связываемого воздуха или меловой кислоты. Следовательно, чистый воздух, проходя через легкие, претерпевает такое же разложение, которое имеет место при горении угля”. Теперь мы знаем, что меловая кислота это ни что иное, как углекислый газ (CO2).

К началу XX века уже было известно, что ткани млекопитающих катализируют окисление органических кислот кислородом воздуха. Тунберг и Виланд предположили существование в тканях дегидрогеназ (активаторов атомов водорода в молекулах субстратов). Варбург же считал, что катализ обусловлен железосодержащим ферментом (дыхательным ферментом), активирующим химически инертный кислород. Оба оказались правы. В тоже время Кейлин обнаружил в тканях пигменты (цитохромы), окраска которых зависела от наличия кислорода в клетке и от активности дыхательного фермента Варбурга. В 50х годах стало ясно, что некоторые дегидрогеназы, цитохромы Кейлина и дыхательный фермент Вырбурга (дыхательная цепь) прочно связаны с внутренними мембранами митохондрий. В 60х годах Грин разработал методы разделения, выделения и очистки компонентов дыхательной цепи.

Уже в 30х годах была установлена тесная связь между процессами окисления (поглощения кислорода) и образования АТФ (фосфорилирование), но вот природа это связи была непонятна вплоть до 60х годов.

В 1961 году Митчелл предложил идею хемиосматического энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Можно выделить три основных положения принципа хемиосматического сопряжения [54]:


  1. Внутренняя мембрана митохондрий, где происходят окислительно-восстановительные реакции дыхания, непроницаема для ионов водорода (Н+) (точнее, протон диффундирует через двойной фосфолипидный слой очень медленно по сравнению со скоростью потребления кислорода). В то же время мембраны хорошо проницаемы для воды и благодаря электролитической диссоциации Н2О D Н+ + ОН- запас протонов в водных растворах неограничен.

  2. Внутренняя мембрана митохондрий ассиметрична: одни компоненты дыхательной цепи контактируют с матриксом (например, активный центр комплекса I), другие расположены внутри мембраны (например, убихинон), третьи контактируют с межмембранным пространством (например, цитохром с).

  3. Разрушение мембраны не препятствует окислению НАДН кислородом, а даже ускоряет дыхание. Энергетическое сопряжение (синтез АТФ) при этом полностью прекращается: происходит разобщение процессов переноса электронов и запасания энергии. Для разобщения необязательно полностью разрушать мембрану – достаточно, сохраняя ее структуру, добавить вещества, резко повышающие проницаемость мембраны для протонов.

Спустя примерно двадцать лет хемиосмотическая концепция сопряжения транспорта электронов и образования АТФ в дыхательной цепи стала общепринятой теорией. И по сей день продолжаются работы по изучению и детальной расшифровки всех участников дыхательной цепи.

Организация дыхательной цепи

Дыхательная цепь является частью процесса окислительного фосфорилирования. Компоненты дыхательной цепи катализируют перенос электронов НАДН+Н+ или восстановленного убихинона (QH2) на молекулярный кислород. Из-за большой разности окислительно-восстановительных потенциалов донора (НАДН+Н+ и, соответственно, QH2) и акцептора (О2) реакция является высоко экзергонической. Большая часть выделяющейся при этом энергии используется для создания градиентов протонов и, наконец, для образования АТФ с помощью АТФ-синтазы.

Дыхательная цепь включает три белковых комплекса (комплексы I III IV), встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану, и две подвижные молекулы-переносчики – убихинон (кофермент Q) и цитохром с (рис. 9). Сукцинатдегидрогеназа, принадлежащая собственно к цитратному циклу, также может рассматриваться как комплекс II дыхательной цепи. АТФ-синтаза иногда называется комплексом V, хотя она не принимает участие в переносе электронов.

Комплексы дыхательной цепи построены из множества полипептидов и содержат ряд различных окислительно-восстановительных коферментов, связанных с белками. К ним принадлежат флавин (ФМН) или ФАД, в комплексах I и II, железосерные центры (в I, II и III) и группы гемма (II, III и IV).


Электроны поступают в дыхательную цепь различными путями. При окислении НАДН+Н+ комплекс I переносит электроны через ФМН и Fe/S- центры на убихинон. Образующиеся при окислении сукцината, ацил-КоА и других субстратов электроны переносятся на убихинон комплексом II или другой митохондриальный дегидрогеназой через связанный с ферментом ФАДН2 или флавопротеин. При этом окисленная форма кофермента Q восстанавливается до ароматического убигидрохинона. Последний переносит электроны на комплекс III, который поставляет их через два гемма b, один Fe/S- центр и гемм с1 на небольшой геммсодержащий белок цитохром с. Последний переносит электроны к комплексу IV, цитохром с-оксидазе. Цитохром с-оксидаза содержит для осуществления окислительно-восстановительных реакций два медьсодержащих центра. (Cua и Cub) и геммы а и а3, через которые электроны, наконец, поступают к кислороду. При восстановлении О2 образуется сильный основной анион О2-, который связывает два протона и переходит в воду. Поток электронов сопряжен с образованными комплексами I, III и IV протонным градиентом.

Рассмотрим теперь по подробнее все комплексы, составляющие дыхательную цепь.



7.Комплекс I или НАДН-убихинон-редуктаза.

Комплекс I (НАДН-убихинон-редуктаза) (рис. 10) катализирует транспорт восстановительных эквивалентов от НАДН к убихинону, чувствительный к действию ротенона и пиерицидина и сопряженный с запасанием энергии. Это самый большой и сложно устроенный комплекс дыхательной цепи. Он состоит из 14 (у бактерий)-45 разных полипептидов с общей молекулярной массой 600-900 кДа, ФМН-содержащего флавопротеида, 16-24 атомов негемового железа и эквивалентного количества лабильного сульфида [27].По форме НАДН-дегидрогеназа напоминает “старый башмак”, он не помещается в мембране и частично торчит “голенищем” наружу. Или НАДН-дегидрогеназа имеет L-образную форму и частично выдается из мембраны.



Рисунок 10: Комплекс I (NADH-убихинон-редуктаза).

7 пептидов комплекса I кодируются митохондриальным геномом [28], остальные - ядерным (импортируються из цитозоля в митохондрии). Большинство редокс-центров связано с двумя фрагментами комплекса: флавопротеином (Фп) (или НАДН-дегидрогеназой) и железобелком (IP). Первый содержит ФМН и некоторые из FeS-кластеров, в то время как в состав второго входят только железосерные центры.



Флавопротеин состоит из трех полипептидов в соотношении 1:1:1 (массы 51, 24 и 10 кДа). Он катализирует окисление НАДН некоторыми искусственными акцепторами электронов (но не природным акцептором KoQ). Тяжелая субъединица связывает НАДН, она содержит ФМН (рис.11) и четыре атома железа. Перенос водорода от НАДН к ФМН специфически тормозится реином.
Средняя субъединица, скорее всего, содержит FeS-кластер с двумя атомами железа (рис. 12). FeS-кластеры FeSI1a и FeSI1b связаны с большой субъединицей Фп (их потенциалы -0,37 и -0,22 соответственно). В мембране Фп не доступен для гидрофобных модификаторов белка, а, значит, прикрыт другими белковыми субъединицами или фосфолипидами.
Фрагмент IP содержит 6 полипептидов (75, 49, 30, 18, 15 и 13 кДа) и 12 атомов железа. FeS-кластеры содержат по четыре атома железа, два из них ассоциированы с 75 и 49 кДа-полипептидами, которые пересекают мембрану и обращены в водную фазу. Третий кластер ассоциирован с эквимолярным комплексом субъединиц 30 и 13 кДа. Редокс-потенциалы всех кластеров похожи - около – 0,24 В. Один из кластеров (FeSI3) локализован вблизи ФМН.
Рисунок 12: Fe-S кластеры.

На долю Фп и IP приходиться около 30% от общего количества белка комплекса I, а остальной белок содержит FeSI2-кластер (-0,02 В), который играет роль восстановителя убихинона (рис.11). Между FeSI2 и KoQ локализован участок торможения комплекса ротеноном, пирицидином, барбитуратами (например, амптал) и некоторыми аналогами KoQ.


Таким образом, с НАДН электроны передаются на ФМН, после чего через цепь FeS-кластеров доходят до FeSI2, где происходит восстановление убихинона до убихинола.
Рисунок 13: Схема передачи электронов от ФМН через FeS-кластеры на убихинон.

Также убихинон является акцептором электронов в реакции окисления сукцината до фумарата, которую катализирует комплекс II дыхательной цепи.



8.Комплекс II (или сукцинатдегидрогеназа).

Комплекс II меньше и проще устроен, чем комплекс III. Это фермент класса оксидоредуктаз; он состоит из 4 субъединиц (с молекулярными массами около 70, 30, 14 и 12 кДа) и содержит в качестве окислительно-восстановительных групп флавинадениндинуклеотид (рис. 11) (ФАД ковалентно связан с самой тяжелой субъединицей) и 3 Fe-S-кластера (рис. 14) (ассоциированы с 30 кДа субъединицей). Малые субъединицы (С и D) сукцинатдегидрогеназы высших организмов (и фумаратредуктазы микроорганизмов) содержит гем группы b и сайт связывания убихинона, который является конечным акцептором электронов. Субъединицы С и D интегрированы в мембрану, субъединицы А и В (большие субъединица) расположены в матриксе. Активный центр (содержит остатки аргинина, цистеина и гистидина), связывающий сукцинат, локализован на самой тяжелой субъединице А. Субъединица А также содержит ФАД. Fe-S центры локализованы в субъединице B. Сукцинатдегидрогеназа проявляет оптимальную каталитическую активность при рН 7,5-8 [29].

Таким образом, электроны с сукцината передаются на ФАД, с которого переносятся на Fe-S центры, а потом уже достигают CoQ (этот путь по длине равен 40А, тогда как 11 А - максимальное расстояние для быстрого транспорта электронов) (рис.14).

9.Кофермент Q.

Исследование коэнзим Q (CoQ) началось с 1955 год, когда Фестенштейн выделил и охарактеризовал его [30]. Уже через два года Крейн показал, что убихинон является компонентом дыхательной цепи митохондрий [31], а спустя год после этого, Вольф выявил и его химическую структуру (рис.15) [32]. Первое время кофермент Q рассматривался только как переносчик электронов от комплексов I и II к комплексу III. Позже в ряде работ была доказана незаменимая роль CoQ как переносчика дыхательной цепи - извлечение и последующее добавление коэнзим Q в субмитохондриальные частицы приводило к инактивации, а затем реактивации комплексов I и II [33]. В 1975 году Митчелл [34] предложил механизм (названный «петля Митчелла»), по которому осуществляется транспорт электронов с митохондриальных дегидрогеназ на комплекс III дыхательной цепи.



Метаболизм кофермента Q

Гибсон изучил путь биосинтеза CoQ на мутантных штаммах E. Coli [36] путем введения мутаций по восьми ubi генам (А-Н), ответственным за ферменты биосинтеза CoQ. Вообще, убихинон (UQ) представляет собой молекулу, в состав которой входит 2,3-диметокси-5-метил-бензохиноновое кольцо, соединенное в шестом положении с гидрофобным изопреноидным хвостом (от 6 до 10 звеньев). В клетке изопреноидная цепь синтезируется в составе полипренилпирофосфата через мевалонатный путь. Предшественник же хиноидного кольца– р-гидроксибензоат– синтезируется из аминокислот тирозина или фенилаланина. Специальная трансфераза (ubi A) «сшивает» эти молекулы, и затем происходит декарбоксилирование, гидроксилирование и метилирование кольца в определенных положениях. В аэробных условиях в гидроксилировании задействован молекулярный кислород, а в анаэробных – вода. Метилирование идет за счет аденозилметионина. Похожие механизмы синтеза были обнаружены для дрожжей и клеток печени крыс, где основные различия процессов касаются порядка и типа модификаций бензохинонового кольца [37].



Функции кофермента Q:

Исследования последних лет показали, что помимо основной своей функции переносчика электронов в дыхательной цепи, кофермент Q выполняет еще ряд немаловажных функций.

Так, кофермент Q и его метаболиты являются важнейшими естественными гидрофобными антиоксидантами, предотвращающими перекисное окисление липидов, карбонилирование белков и накопление токсичных продуктов. Предотвращение опосредованного окислительным стрессом повреждения внутриклеточных структур, в первую очередь митохондрий, препятствует инициации гибели клеток по апоптотическому пути и тканевой дисфункции, приводящей к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний, ишемии сердца и других патологических проявлений, а также при старении. CoQ участвует и в различных транспортных системах.

В эукариотических клетках существует специальная система транспорта электронов через плазматическую мембрану. НАДН-зависимая CoQ-редуктаза на внутренней стороне плазмалеммы восстанавливает убихинон, который, в свою очередь, переносит электроны на фермент НАДН-оксидазу (NOX локализованна на внешней стороне мембраны). NOX называется так, потому что раньше думали, что она функционирует как фермент, окисляющий экзогенный НАДН. А на самом деле основными терминальными акцепторами электронов, восстанавливаемыми NOX, являются внеклеточные радикалы аскорбата, молекулярный кислород (до воды или супероксида O2.) и белковые дисульфидные связи.

Предположительно, CoQ-зависимая NOX участвует в процессах регуляции уровня NADH в цитозоле, а также может быть связана с регуляцией клеточного роста и дифференцировки. Крейн предполагает возможное участие локализованного в плазмалемме CoQ в активации тирозин киназы и запуске ряда сигнальных путей, приводящих к ранней экспрессии генов [10]. В результате окисления убисемихинона образуется перекись водорода, индуцирующая тирозин киназу (H2O2 скорее всего выполняет сигнальную роль).

CoQ также участвует в экстра-митохондриальном электронном транспорте. Лизосомы тоже содержат НАДН-зависимую CoQ редуктазу, которая, возможно, участвует в образовании кислой среды лизосомального люмена. В этом случае восстановление CoQ рассматривается как два последовательных одноэлектронных процесса, с участием ФАД и цитохрома b5, а молекулярный кислород выступает в роли терминального акцептора [37].

CoQ принимает участие в регуляции физико-химических свойств мембран, проницаемости митохондриальных мембран (взаимодействует с РТР, permeability transition pore) и в активации митохондриальных разобщающих белков (uncoupling proteins, UCP).

Во внутренней мембране митохондрий локализован ряд белков-разобщителей (uncoupling proteins, UCPs), которые способны транслоцировать протоны из межмебранного пространства внутрь митохондрий [38]. Создаваемый дыхательной цепью протонный градиент оказывается разобщенным с процессом окислительного фосфорилирования, и запасаемая в виде ΔμH энергия частично рассеивается, не переходя в энергию макроэргических связей АТФ.

Известно пять различных белков-разобщителей в митохондриях многих растений и животных (гены ucp 1-5 для человека). Наиболее изученный белок UCP1 локализован в буром жире, он активно функционирует и ответственен за термогенез. В остальных тканях, где разобщение не играет такой масштабной роли, белки-разобщители представлены в небольших количествах. Помимо термогенеза, предполагается участие UCPs в подавлении генерации кислородных радикалов, а также их причастность к таким болезням, как ожирение и диабет. Эчтай (Echtay) использовал липосомы со встроенными в них бактериальными UCPs и показал, что CoQ является облигатным кофактором для этих белков [12]. Добавление CoQ в смеси с жирными кислотами к липосомам активировало транспорт протонов разобщающими белками, и наоборот, транспорт прекращался в отсутствие коэнзима Q. При этом CoQ с маленькой длиной изопреноидного хвоста (0-2 единицы) практически не взаимодействуют с UCPs, максимальная же активность наблюдается при введении CoQ10. Предполагается следующая схема участия CoQ в функционировании UCP: протон с жирных кислот переносится молекулой CoQ на некоторую акцепторную группу белка-переносчика, который уже переправляет его в матрикс.

Внутренняя мембрана митохондрий малопроницаема для различных ионов и небольших молекул. Транспорт необходимых веществ осуществляется через специальные белковые транспортеры и ионные каналы. Такая непроницаемость необходима для формирования протонного градиента, но иногда, вследствие явления неспецифической проницаемости мембраны (мембрана теряет свои барьерные функции и становится проницаемой для всех молекул с молекулярной массой до 1,5 кДа), протонный градиент теряется, нарушается баланс ионов, происходит гидролиз АТФ [21].

Кроме того, показана критичность резкого изменения проницаемости внутренней митохондриальной мембраны при апоптозе, одной из начальных стадий которого является выход проапоптических белков из митохондрий в цитоплазму (цитохром с, прокаспаза-9 и др.) [22]. Такая неспецифическая проницаемость связана с особым внутренним митохондриальным комплексом РТР (permeability transition pore) [13]. На комплекс РТР влияет целый ряд факторов (более 40), в том числе концентрация ионов кальция в матриксе, скачки мембранного потенциала, рН матрикса, циклоспорин А, окисленные глутатион и пиридиновые нуклеотиды, образующиеся при оксидативном стрессе, коэнзим Q и его гомологи (и как ингибиторы, и как индукторы). Предполагается, что хиноны влияют на РТР через взаимодействие с неким сайтом связывания, а не через характерные окислительно-восстановительные реакции [23]. Похоже, что в случае использования аналогов CoQ играет роль не тип заместителей в бензохиноновом кольце, а длина и степень насыщенности изопреноидной цепи. Коэнзим Q (как ингибитор) способен предотвращать деполяризацию внутренней митохондриальной мембраны, выход цитохрома с и активацию каспазы-9 в кераноцитах в ответ на апоптические стимулы, в связи с чем можно предположить его ингибирующий эффект на открытие неспецифической митохондриальной поры.

Также CoQ участвует в модуляции количеств β2-интегринов, презентируемых на поверхности моноцитов крови и в восстановлении функций эндотелия в случае их нарушения. Еще он окисляет сульфид в дрожжах и принимает участие в образование дисульфидных связей в бактериях.



Физико-химические свойства кофермента Q

Кофермент Q является редокс-компонентом митохондриальной или бактериальной электрон-транспортной цепи. Он существует преимущественно в двух формах – окисленной (убихинон) и восстановленной (убихинол) (рис.15). Убихинон (UQ) – это 2,3-диметокси-5-метил-бензохиноновое кольцо, соединенное в шестом положении с гидрофобным изопреноидным хвостом (от 6 до 10 звеньев). Бензохиноновое кольцо обладает относительной полярностью по сравнению с длинной боковой цепью (является чем-то вроде полярной головки), но при этом и достаточно гидрофобно, потому что включено в мембранный бислой. Принимая два элетрона и два протона от митохондриальных убихинон-редуктаз, UQ восстанавливается до ароматического убихинола (UQH2).


Рисунок 15: Кофермент Q и его редокс-формы (убихинон/убихинол)(James et. al, 2004).
Как убихинон, так и убихинол хорошо растворимы в обычных липидных растворителях: ацетоне, диэтиловом эфире, хлороформе, этаноле, петролейном эфире,- которые и используются для экстракции CoQ из мембран. Коэффициенты распределения хинолов в системе циклогексан/ вода обычно ниже, чем для хинонов, поскольку появляются два доступных для формирования водородных связей протонов. При этом метокси-группы в положениях 2 и 3 у CoQ в достаточной степени выравнивают эти коэффициенты, так как образуется внутримолекулярная водородная связь (рис.15), и протон гидроксильной группы становится гораздо менее доступным для образования внешних водородных связей. Коэффициенты распределения в системе октанол/вода для хинонов и хинолов также схожи, поскольку водородные связи с октанолом образуются в равной степени для обеих редокс-форм. Таким образом, окисленная и восстановленная формы CoQ будут, в грубом приближении, одинаково распределяться в мембранном бислое: как в его центре, схожем по гидрофобности с циклогексаном, так и ближе к поверхности, схожей с октанолом [35].

Помимо двух основных наиболее стабильных форм, кофермент Q имеет еще и другие короткоживущие нестабильные протонированные и окисленные формы, участвующии в процессах последовательного одноэлектронного переноса электронов в клетке (рис. 16)

Так, в реакции окисления UQH2 до UQH2+ убихинол представляет собой весьма слабый восстановитель (> 850 мВ), тогда как образующийся при потере протона анион UQH (1) уже более активен (~190 мВ), и может отдать электрон мягким клеточным окислителям (2). Получившийся убисемихинон-радикал UQH* отдает второй протон (3), образуя убисемихинон радикал анион UQ, который является сильным восстановителем (~ -240  -230 мВ); последний отдает электрон и превращается в убихинон UQ (4).

Обратная реакция восстановления убихинона до анионной формы радикала может быть осуществлена только сильными восстановителями (5), при этом последующая стадия образования аниона UQ2- проходит легко (6). Анион же, в свою очередь, присоединением двух протонов превращается в убихинол. В данном случае в ходе восстановления убихинона происходит последовательное присоединение сразу двух электронов, тогда как при окислении убихинола перенос электронов разделен акцептированием протонов.

Содержание CoQ в митохондриях различных тканей неодинаково (1-4.5 нмоль CoQ на мг белка (у грызунов)). Так больше всего CoQ на мг белка приходиться на клетки сердечной и скелетных мышц, а на клетки мозга и печени приходиться всего 1 нмоль CoQ на мг белка. Кофермент Q свободно перемещается в билипидном слое внутренней мембраны. Изопреноидный хвост располагается в центре бислоя параллельно поверхности, заякоривая молекулу внутри мембраны. Бензохиноновое кольцо также погружено в мембрану, но способно менять свою пространственную ориентацию, тем самым, обеспечивая перенос электронов: кольцо может располагаться как в середине бислоя параллельно поверхности, так и вдоль ацильных цепей перпендикулярно поверхности, но не ближе1-2 нм к поверхности. Таким образом, CoQ не взаимодействует с растворенными в матриксе восстановителями типа глутатиона и аскорбата.
Рисунок 16: Редокс-формы СoQ и их взаимопревращения

Для гомологов CoQ c достаточно длинной боковой цепью молекулярная динамика и минимизация энергии показали свернутую структуру молекулы: последняя изопреноидная единица находится в тесном контакте с бензохиноновым кольцом. То же показано для анионных и радикальных интермедиатов с помощью EPR [9].

Таким образом, убихинон объединяет в себе свойства донора двух электронов и акцептора одного электрона, подобно другим важным переносчикам в цепи - флавопротеинам [35].

Вообще перенос восстановительных эквивалентов представляет собой векторный процесс, в результате которого создается ΔμH. К дегидрогеназам, принимающим восстановительные эквиваленты от различных субстратов и переносящим их на СоQ, относятся: комплекс I (НАДН -убихинон оксидоредуктаза – входит в состав), комплекс II (сукцинатдегидрогеназа), дигидрооротат дегидрогеназа, глицерол-3-фосфат дегидрогеназа, а также ряд растительных и дрожжевых НАДН-дегидрогеназ, не участвующих в создании протонного градиента. Эти ферментативные комплексы восстанавливают убихинон до убихинола, а он, в свою очередь, окисляется комплексом III (в клетках млекопитающих) или рядом альтернативных оксидаз (дрожжи, растения). Комплекс III осуществляет векторный транспорт электронов от убихинола к цитохрому с.



10.Комплекс III (комплекс bc1 или убихинол цитохром с оксидоредуктаза)

Комплекс III представляет собой димер из двух идентичных мономеров, состоящих из 11 белковых субъединиц. Функциональное ядро каждого мономера состоит из трех субъединиц: цитохрома b (содержит два гема bh(566) и bl(562)), белка Риске с железосерными кластерами 2Fe-2S и цитохрома с1 с одним гемом с (рис 17).


Рисунок 17: Функциональное ядро комплекса III.

Цитохром b – белок массой около 45 кДа - погружен в мембрану и состоит из 9 α-спиралей, 8 из которых пересекают мембрану (трансмембранные). Это полипептид кодируется мтДНК. Цитохром b (рис. 20) содержит два гемма - bh и bl, которые расположены между 2ой и 5ой α-спиральными колоннами и связаны с белком по крайней мере тремя связями. Две из них образуются имидазольными группами остатков гистидина белка и железом гемма, а третья – положительно заряженной группой остатков аргинина или лизина белка и отрицательно заряженной пропионатной группой гемма. Гемм bl, расположен ближе к межмембранному пространству, а bh - ближе к цитозолю (рис. 19).

FeSIII белок (белок Риске или фактор Слейтера) – полипептид массой 21,5 кДа (состоит из 199 аминокислот), который содержит один 2Fe-2S кластер (рис. 12). BAL и Zn сильно тормозят перенос электронов с Fe-2 кластера на цитохром с.

Цитохром с1,белок массой 28 кДа, содержит один гем с (рис. 19), который вместе с железо-серным белком комплекса III образует место связывания с цитохром с на обращенной в межмембранное пространство стороне внутренней мембраны.

В комплексе bc1 есть два сайта взаимодействия с коэнзимом Q - QN и Qp (рис. 17). Субъединицы комплекса III взаимодействуют между собой с образованием двух «карманов», где и происходят реакции Q-цикла. Сайт QN находится ближе к обращенной к матриксу стороне мембраны (сторона N), и именно с ним связывается ингибитор дыхания антимицин А, блокируя перенос электрона с гема bh на убихинон. Сайт Qp находится ближе к межмембранному пространству (сторона Р), и с ним связывается другой ингибитор– миксотиазол, блокируя перенос электрона с убихинола на железосерный кластер.


Общее соотношение UQH2/UQ в CoQ пуле определяется интенсивностью дыхания клетки. В состоянии 4, когда митохондрия не синтезирует АТФ, уровень дыхания низкий, и пул CoQ относительно восстановлен. В состоянии же 3, когда происходит активный синтез АТФ, дыхание идет быстро, приводя к окислению пула CoQ. В изолированных митохондриях доля восстановленной формы в случае низкой интенсивности дыхания составляет 75-90%, а в случае высокой– 50-60% (молекула CoQ изменяет свой редокс-статус каждые 50 мсек) [35]. Ингибирование комплексов III и IV и добавление субстратов для комплекса I или II сдвигает соотношение UQH2/UQ в сторону восстановленной формы, и наоборот.

В ходе Q-цикла две молекулы UQH2 окисляются в Р-сайте, высвобождая в межмембранное пространство по два протона на каждую молекулу; один электрон от каждой молекулы UQH2 идет на цитохром с1, а второй– на расположенную в N-сайте молекулу UQ через гемы цитохрома b. Таким образом, принимая последовательно два электрона от двух молекул UQH2 и два протона, одна молекула UQ восстанавливается, при этом промежуточным интермедиатом является убисемихинон анион радикал:

UQH2 +UQ′ + Сyt c1 (ox) → UQ′.– + 2H+p + Сyt 1(red) + UQ,

UQH2 + UQ′.– + 2H+N + Сyt c1 (ox) → UQH′2 + UQ + 2H+p + Сyt с1(red)

Несмотря на сложность процесса, результирующая реакция проста, и отражает перенос электронов с убихинола на цитохром c1 и транспорт протонов через мембрану:

UQH2 + 2 Сyt c1 (ox) + 2H+N → Q + 2 Сyt c1(red) + 4H+p .

В ходе данного процесса происходит миграция молекул CoQ в толще мембранного бислоя между сайтами Qp и QN и образование в этих сайтах убисемихинон радикалов.

С цитохрома c1 электрон передается на цитохром с, который восстанавливает цитохромоксидазу.



11.Цитохром с.



Цитохром с является относительно небольшим (масса 12кДа, состоит из 104 аминокислот) водорастворимым белком, локализованным на межмембранной поверхности внутренней митохондриальной мембраны. Он содержит гемм с (рис. 19), ковалентно связанный с апобелком. Цитохрома c совершает челночные движения между цитохромом c1 и цитохромоксидазой, перемещаясь вдоль поверхности мембраны. Кардиолипин участвует в связывании цитохрома с с мембраной.

12.Комплекс IV (цитохромоксидаза).

Это последний комплекс дыхательной цепи, передающий электроны от цитохрома с на молекулярный кислород, окисляя его до Н2О. Цитохромоксидаза - это большой фермент (масса 240 кДа) внутренней мембраны митохондрий, состоящий из 13 субъединиц у млекопитающих, и 3 или 4 - у бактерий. Функциональное ядро содержит четыре редокс-центра: два гемма а-типа (гемм а и гемм а3) (рис. 20) и два атома меди (CuA и CuB) (рис.21).

10 регуляторных субъединиц комплекса кодируются ядерным геномом и синтезируются в цитоплазме: IV (17 кДа), V (12,5 кДа), VIa (10,5 кДа), VIb (9,5 кДа), VIc (8,5 кДа), VII (10 кДа), VIIIa (5,5 кДа), VIIIb (5 кДа), VIIIc (6 кДа).
Рисунок 21: Комплекс IV.

Три субъединицы этого комплекса кодируются митохондриальным геномом. Субъединица III (30 кДа) 7 раз пересекает мембрану. Субъединица II (26 кДа) содержит CuA-центр, состоящий из двух ионов Cu в комплексе с –SH группами двух Cys (похож на 2Fe-2S-центр). Кроме того, в субъединице II находятся две гидрофобные последовательности, два раза пересекающие мембрану. Субъединица I (57 кДа) содержит остальные редокс-центры, как-то: две группы геммов а и а3 и CuB-центр. Гемм а3 и CuB формируют второй двуядерный центр, который принимает электроны с гемма а и передает их на О2, связанный с геммом а3. Таким образом, электрон с цитохрома с передается на CuA-центр, далее на гемм а, а после на гемм а3 - CuB –центр. С CuBа3 – центра электрон переноситься на кислород. Ингибиторами этой реакции являются KCN, CO, H2S и азид.


На каждые четыре электрона, проходящие через комплекс, фермент принимает четыре субстратные Н+ из матрикса (N-side) для восстановления О2 в Н2О. Так же фермент использует энергию этой реакции для переноса через мембрану в межмембранное пространство одного Н+ на каждый перенесенный электрон.

Суммарная реакция, катализируемая цитохромоксидазой:

4 Cyt c (red) + 8 Н+N + О2 →4 Cyt c (ox) + 4 Н+p + Н2О

Это четырехэлектронное восстановление О2 затрагивает редокс центры, которые несут только по одному электрону, что вызывает образование интермидиатов (перекиси водорода и гидроксильного радикала), которые связываются комплексом до образования воды.

В итоге, на каждую пару электронов, переносимую на молекулу О2 приходиться четыре Н+, выкаченных комплексом I, четыре – комплексом III и два – комплексом IV (рис. 22).

Векторное уравнение этого процесса можно записать следующим образом:

NADH + 11 Н+N + 1/2О2 → NAD+ + 10 Н+p + Н2О

Таким образом, перенос двух электронов от NADH к О2 сопровождается переносом через мембрану 10 Н+, в результате чего протоны в межмембранном пространстве накапливаются, создавая протонный градиент. Н+-АТФ-синтаза – фермент, катализирующий фосфорилирование АДФ неорганическим фосфатом с образование АТФ за счет электрохимическая энергия протонного градиента ΔμН. Синтез АТФ сопряжен с обратным потоком протонов из межмембранного пространства в матрикс.



13.Н+-АТФ-синтаза

Первой была открыта и изучена бактериальная Н+АТФ-синтаза, митохондриальная Н+АТФ-синтаза имеет аналогичное строение.

Н+-транслоцирующая АТФ-синтаза E.coli состоит из двух субкомплексов: встроенного в мембрану протонного канала (F0) и каталитической субъединицы (F1), выступающей в матрикс (рис.23). Фактор F0 состоит из трех типов субъединиц (а (30 кДа), b (17 кДа), с (8 кДа)), а фактор F1-из пяти (α (55 кДа), β (50 кДа), γ (31,5 кДа), δ (19,5 кДа), ε (15 кДа)) (рис. 25). Так, «головка» каталитической части образована тремя α- и тремя β- субъединицами, между которыми расположены три активных центра. "Ствол" структуры образуют полипептиды F0-части и γ-, δ- и ε-субъединиц головки.

Митохондриальная Н+АТФ-синтаза гомологична бактериальной, но несколько тяжелее и сложнее устроена. Так, в Н+АТФ-синтазе митохондрий присутствуют пять полипептидов, которые отсутствуют у бактерий: ε-субъединица фактора F1 (5,5 кДа), субъединица AL6 фактора F0 (22 кДа), фактор F6 (9 кДа), белковый ингибитор фактора F1 (9,5 кДа), субъединица правильного связывания F1 с F0 (18,5 кДа). Белок OSCP – это белок, обусловливающий чувствительность к олигомицину. Он необходим для правильного связывания F1 с F0. Крупные α- и β- субъединицы очень консервативны (70% сходства), а белок OSCP гомологичен частям δ- и b- субъединиц E.coli, субъединица 9 гомологична субъединице с E.coli.

У животных и дрожжей все субъединицы фактора F1 кодируются ядерным геномом и синтезируются в цитоплазме; у растений, α-субъединица закодирована в мтДНК, а β- субъединица – в ядре, другие сведения отсутствуют.

Н+АТФ-синтаза – это очень массивный белковый комплекс, локализованный во внутренней мембране митохондрий. Н+АТФ-синтаза сильно выдается своей каталитической частью (фактором F1) в матрикс митохондрии. Каталитический цикл (рис.26) подразделяется на три фазы, каждая из которых проходит поочередно в трех активных центрах. Вначале происходит связывание АДФ и Фн (1), затем образуется фосфоангидридная связь (2) и, наконец, освобождается конечный продукт реакции – АТФ (3). При каждом переносе протона через белковый канал F0, в матрикс все три активных центра катализируют очередную стадию реакции.

Согласно хемиосмотической концепции, движение электронов по дыхательной цепи является источником энергии для транслокации протонов через митохондриальную мембрану. Возникающая при этом разность электрохимических потенциалов (ΔμH+) приводит в действие АТФ-синтазу, катализирующую реакцию АДФ+ Фн D АТФ.

В дыхательной цепи есть только 3 участка, где перенос электронов сопряжен с накоплением энергии, достаточным для образованияАТФ, на других этапах возникающая разность потенциалов для этого процесса недостаточна. Максимальная величина коэффициента фосфорилирования, таким образом, составляет 3, если реакция окисления идет с участием НАД+, и 2, если окисление субстрата протекает через флавиновые дегидрогеназы. Теоретически еще одну молекулу АТФ можно получить в трансгидрогеназной реакции (если процесс начинается с восстановленного НАДФ):

НАДФН + НАД+ D НАДФ+ + НАДН + 30 кДж/моль.

Обычно в тканях восстановленный НАДФ используется в пластическом обмене, обеспечивая разнообразные синтетические процессы, так что равновесие трансгидрогеназной реакции сильно сдвинуто влево.

Эффективность окислительного фосфорилирования в митохондриях определяется как отношение величины образовавшегося АТФ к поглощенному кислороду: АТФ/О или Р/О (коэффициент фосфорилирования). Экспериментально определяемые значения Р/О, как правило, оказываются меньше 3. Это свидетельствует о том, что процесс дыхания не полностью сопряжен с фосфорилированием. Действительно, окислительное фосфорилирование, в отличие от субстратного, не является процессом, в котором окисление жестко сопряжено с образованием макроэргов. Степень сопряжения зависит главным образом от целостности митохондриальной мембраны, сберегающей разность потенциалов, создаваемую транспортом электронов. По этой причине соединения, обеспечивающие протонную проводимость (например, 2,4-ди-нитрофенол), являются разобщителями.

В норме скорость митохондриального транспорта электронов регулируется содержанием АДФ. Выполнение клеткой функций с затратой АТФ приводит к накоплению АДФ, который в свою очередь активирует тканевое дыхание. Таким образом, клетки реагируют на интенсивность клеточного метаболизма и поддерживают запасы АТФ на необходимом уровне, т.е. осуществляют дыхательный контроль.

За сутки человек потребляет около 550 л (24,75 моля) кислорода. Если считать, что в тканевом дыхании за этот период восстанавливается 40 г атомов кислорода (20 молей), а величину Р/О принять за 2,5, то в митохондриях должно синтезироваться 100 молей, или около 50 кг АТФ! При этом часть энергии окисления субстратов расходуется на совершение полезной работы, не превращаясь в АТФ.

В дыхательной цепи электроны не всегда достигают места назначения – нередко они выпа-дают из цепи, образуя активные формы кислорода (АФК), концентрация которых в матриксе в 5-10 раз превышает содержание оных в цитоплазме. Что же собой представляют АФК?






Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница