Руководство оператора



страница5/6
Дата17.11.2018
Размер0.68 Mb.
ТипКурсовая
1   2   3   4   5   6



Аналоги убихинона.

Таким образом, коэнзим Q является антиоксидантом клетки. Многие заболевания и общее старение организма связано с тем, что митохондрии не справляются с детоксикацией АФК. Поэтому изучение и возможное терапевтическое применение антиоксидантов (в частности, CoQ и его аналогов) представляет очень большой интерес. Можно попытаться распознать функцию CoQ, изменяя содержание CoQ внутри митохондрий, но для повышения концентрации CoQ в митохондрии необходимо адресовано ввести кофермент в изолированные митохондрии, клетки или же организмы. Вследствие гидрофобности и соответственно низкой растворимости в водной среде возникает проблема доставки CoQ и, следовательно, и его изучения in vitro.

Для повышения концентрации аналогов хинонов, животным в течение нескольких недель дают пищу обогащенную хинонами, так что во всех тканях устанавливается стабильная необходимая для исследований концентрация. Эти соединения могут с помощью кровотока равномерно распределяться в тканях; так их активные формы были обнаружены в наиболее подверженных окислительному стрессу тканях, то есть в мозге, печени, сердце и мышцах животных. При этом концентрация аналогов хинонов в митохондриях в несколько сот раз выше, чем в кровотоке. Аналоги хинонов при необходимости легко выводятся из тканей, возвращаясь опять в кровь и достаточно быстро экскрегируются из организма при отмене диеты.

Гидрофобность коэнзима определяется в первую очередь его боковой изопреноидной цепью. Менее гидрофобные, но по-прежнему активные производные CoQ могут быть получены путем замены длинной боковой цепи на более водорастворимые «хвосты». Такие производные CoQ широко используются в качестве электронных доноров и акцепторов при изучении ферментов и для повышения содержания коэнзима в митохондриях и клетках. Биологическая активность подобных искусственно синтезированных аналогов CoQ должна в значительной степени сохраняться, так как в передаче электронов участвует бензохиноновое кольцо, а боковая цепь выполняет только функцию заякоривания молекулы в мембране.

Как правило, такие производные (рис. 32) имеют либо очень короткую боковую цепь из одной - двух изопреноидных звеньев в позиции 6 (коэнзимы Q1, Q2), либо более простую алифатическую боковую цепь без разветвлений (децилубихинон) или модифицированную гидроксилом или другой гидрофильной группой (например 10-гидроксидецил в идебеноне) [75]. В любом случае, даже подобные аналоги CoQ все еще достаточно гидрофобны, и, при попытке их введения в биологические системы, неспецифично включаются во все фосфолипидные бислои, и только маленькая часть попадает в митохондриальные мембраны.

Для адресной доставки коэнзима Q в митохондрии перспективно использование конъюгатов с так называемыми липофильными катионами, в том числе с трифенилфосфонием.

Так, аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами трифенилфосфония, образуют ряд молекул (рис.34):


  • MitoQ (mitochondria-targeted ubiquinone)-производное хинона, ковалентно связанное с катионом алкилТРР; MitoQ10 -хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце.

  • Mito Vit Q (mitochondria-targeted derivative of α-tocoferol),

  • spin traps (Mito PBN, mitochondria-targeted derivative of the spin trap phenylbutylnitrone),

  • TBTP, IBTP (тиоловые зонды),

  • MitoDC81 (DNA alkylating reagent).

Еще в 1969 году Скулачевым и коллегами было показано потенциал-зависимое накопление дибензиламмония в митохондриальном матриксе, что дало толчок к изучению накопления липофильных катионов энергизованными митохондриями [72]. Накопление дибензиламмония было весьма слабым и требовало наличия противоиона, в качестве которого использовался липофильный анион тетрафенилборат. В дальнейших исследованиях использовался другой катион– метилтрифенилфосфоний, который не нуждается в противоионе. Таким образом, катионы трифенилфосфония (ТРР) стали применяться в качестве зондов при изучении функций митохондрий.
Рисунок 32: производные коэнзима Q

Липофильные катионы, несмотря на положительный заряд, имеют высокую растворимость в липидах, легко проходят через мембраны бислоя без участия ионофоров и аккумулируются в митохондриях в клетки, движимые высоким потенциалом митохондриальной мембраны. Подобное свойство обусловлено гораздо меньшей по сравнению с гидрофильными катионами типа Na+ энергией активации перехода иона из водной среды в липидное окружение. Эта энергия определяется электростатической и гидрофобной составляющими.

Основной вклад в электростатическую компоненту вносит энергия Бора, которая представляет собой вклад энтальпии, необходимый для удаления гидратирующих катион молекул воды при переносе в липидную фазу из водного раствора. Энергия Бора обратно пропорциональна ионному радиусу катиона, что обусловлено пониженной гидратацией катиона при распределении заряда по большей площади поверхности, которая в этом случае имеет меньшую напряженность электрического поля, поляризующего молекулы воды. Липофильные катионы представляет собой фосфоний, окруженный тремя гидрофобными фенильными группами, за счет чего имеют большойим ионныйм радиус около 4 Ǻ. Таким образом, включение в мембранный бислой липофильных катионов типа тетрафенилфосфония с большим ионным радиусом в 4, 2 Ǻ гораздо менее энергетически невыгодно, чем поглощение маленьких катионов типа Na+ с радиусом ~1 Ǻ.

Помимо энергии Бора существует еще две электростатических составляющих, но которые вносят значительно меньший вклад. Первая обусловлена электростатическими свойствами на границе раздела фаз с различной диэлектрической проницаемостью, а вторая связана с локальным электрическим потенциалом, возникающим во внутренней части мембраны благодаря ориентации диполей карбонильных групп жирных кислот в фосфолипидах. Существование этой дипольной силы объясняет факт о значительно более быстром проникновении анионов сквозь бислой по сравнению с катионами.

В целом электростатические силы препятствует переносу катиона из водной в липидную фазу. Однако существует не менее важная компонента энергии перемещения, обусловленная гидрофобностью катиона. Она способствует включению его в бислой за счет положительного гидрофобного эффекта, который заключается в повышении энтропии, связанном с нарушением структуры воды. Гидрофобный эффект оценивается примерно в 92 Дж/моль на Ǻ2 доступной растворителю поверхности, и, к примеру, для тетрафенилфосфония выигрыш в энергии составит порядка 29 кДж/моль. Помимо этого, гидрофобный эффект возникает сразу после поглощения катиона мембраной, тогда как увеличение отталкивающих электростатических сил возникает постепенно при прохождении через мембрану. Вследствие этого в энергетическом профиле перемещения катиона сквозь бислой помимо центрального энергетического барьера имеются потенциальные «ямы» рядом с поверхностью мембран. Катионы связываются с мембраной, попадают в потенциальную «яму» у поверхности и быстро проходят сквозь гидрофобный центр к противоположной потенциальной «яме», после чего десорбируются в раствор по другую сторону барьера. Таким образом, катионы находяться в динамическом равновесии между формами, связанными с поверхностью внутренней мембраны и свободными формами в растворе, при этом в связанном состоянии находиться примерно 60% ТРМР и 85% тетрафенилфосфония (ТРР). Т.е. в перемещении липофильных катионов через фосфолипидный бислой можно выделить три стадии: адсорбцию, транслокацию и десорбцию (рис.33).
Рисунок 33:Накопление MitoQ10 в митохондрии в ответ на мембранный потенциал Δψ.

Связывание производных трифенилфосфония происходит в большей степени по мере роста гидрофобности боковой цепи из-за увеличения движущей силы энтропийной природы. К примеру, константа ассоциации с бислоем увеличивается в 10 раз при пере-ходе от ТРМР к амилТРР и в 6 раз при переходе к тетраТРР. При этом для всех производных группа ТРР ассоциируется с мембраной в одном и том же положении на гидрофобной стороне раздела липид/вода при одновременном проникании боковой цепи в мембрану, поэтому даже самые гидрофобные производные ТРР быстро проходят сквозь бислой, не задерживаясь в нем из-за липофильности алкильной цепи. Это подтверждается коэффициентами распределения производных ТРР в системе октанол/фосфатный буфер, имитирующей внешний мембранный слой, которые относительно велики: 0,35 у ТРМР и 160 у MitoQ10. При этом коэффициент распределения в имитирующей середину бислоя с низкой диэлектрической постоянной системе циклогексан/вода для MitoQ10 незначителен.

Таким образом, в отсутствии мембранного потенциала в условиях деэнергизованных митохондрий катионы связываются с наружной стороной мембраны, затем преодолевают гидрофобный энергетический барьер липидного бислоя, сявзываются с внутренней стороной мембраны и, наконец, десорбируются в митохондриальный матрикс.

При наличии Δψ перемещение катионов через мембрану приводит к их накоплению в митохондриальном матриксе в соответствии с уравнением Нернста. При Δψ около 60 мВ концентрация катионов в матриксе увеличивается в 10 раз, а при митохондриальном Δψ в 140-180 мВ – в сотни раз (рис. 36).Мера накопления катионов в ответ на мембранный потенциал Δψ описывается уравнением Нернста, где z - это заряд на катион.


При этом уравнение Нернста оперирует концентрациями несвязанных катионов. Значительная часть проникших в митохондрии катионов ТРР связана с внутренней мембраной, что обусловлено большим объемом внутренней мембраны по сравнению с объемом матрикса. Повышение гидрофобности производного приводит к увеличению адсорбции.

Так, при 37°С до логарифмирования фактор равен 61мВ (для монокатионов), в то время как in vivo – приблизительно 120-180 мВ, а концентрация липофильных монокатионов увеличивается в 100-1000 раз внутри митохондрии (используется для измерения Δψ и обнаружения митохондрий в клетке) [76].


Рисунок 34: Адресная доставка в митохондрии с помощью катионов ТРР+ (by Murphy, 2004, [19]).

В свете описанных свойств катионов ТРР+, ковалентное присоединение незаряженных биологически активных соединений к катионам ТРР+ должно приводить к их адресной доставке внутрь митохондрий под действием высокого мембранного потенциала, что позволит исследовать различные вещества и использовать их в терапевтических целях. Рассмотрим некоторые производные хининов поподробнее.

Так аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами алкилтрифенилфосфо-ния, образуют молекулы MitoQ (рис.32), которые имеют различную длину боковой цепи.

Так, например, MitoQ10 – это хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце (рис.32). Эксперименты в данном направлении на изолированных митохондриях и клетках показали, что MitoQ10 эффективно накапливается в митохондриях, включаясь во внутреннюю митохондриальную мембрану со стороны матрикса. Изопреноидный хвост CoQ располагается в центре бислоя параллельно поверхности, заякоривая молекулу внутри мембраны; бензохиноновое кольцо CoQ также погружено в мембрану, но способно менять свою пространственную ориентацию, тем самым, обеспечивая перенос электронов. Молекула же MitoQ ориентирована иначе: бензохиноновое кольцо локализуется в толще бислоя, изопреноидный хвост перпендикулярен поверхности мембраны, а объемный катион ТРР находится на поверхности мембраны, обращенной в матрикс (рис. 35). Для гомологов CoQ c достаточно длинной боковой цепью молекулярная динамика и минимизация энергии показали свернутую структуру молекулы: последняя изопреноидная единица находится в тесном контакте с бензохиноновым кольцом.


Рисунок 35: Ориентация CoQ и MitoQ оносительно мембранного бислоя.

Тем не менее, MitoQ10 может окисляться и восстанавливаться митохондриальной дыхательной цепью и это в основном происходит в активных центрах дыхательных комплексов, а не за счет эндогенного пула убихинонов [74]. Было показано, что MitoQ10 может принимать электроны вблизи комплексов I и II и передавать их на комплекс III, возможно, конкурируя при этом с CoQ, а также эффективно блокирует окислительные повреждения [75].

Таким образом возможно осуществлять и направленный транспорт CoQ в составе MitoQ10, который способен выполнять функции антиоксиданта, а также блокировать многие из предполагаемых путей митохондриальной редокс-сигнализации и регуляции метаболизма, в том числе повреждение теломер, активацию UCP и пути, включающие в себя р53 [73].

Mito Vit Q – это аналог кофемента Q, являющийся производным α-токоферола (рис.32). Поскольку и CoQ и витамин Е проявляют антиоксидоньные свойства и предотвращают перекисное окисление липидов, то был синтезирован аналог убихинона Mito Vit Q. in vitro показано, что Mito Vit Q быстро и избирательно аккумулируются в изолированных митохондриях и в митохондриях изолированных клеток.

Помимо окислительных повреждений, АФК могут выполнять еще и сигнальную функцию, механизм которой пока еще малоизучен. Адресованные антиоксиданты могут так же использоваться для выслеживания сигнальных путей. Так с помощью Mito PBN (spin trap) (рис. 32) показали, что супероксид индуцирует активацию разъединения белков через образование из карбонильных радикалов фосфолипидов [73]. Mito PBN также модулирует роль продукции АФК в предполагаемых сигнальных путях внутри клетки.

Таким образом, катионы ТРР (трифенилфосфония), связанные с антиоксидантами и другими зондами, избирательно направляют их (связанные с ТРР молекулы) в митохондрии внутри клеток и in vivo. Это использует для изучения окислительного повреждения и, возможно, лечения вызываемых АФК заболеваний.

Ученые стремились улучшить количество и селективность доставки антиоксидантов в митохондрии iv vivo, заменив липофильный монокатион на дикатион (рис.30), который теоретически должен был быть значительно более эффективным. Подобное предположение возникло исходя из уравнения Нернста: на каждое повышение мембранного потенциала на 60мВ дикатионы накапливаются 100-кратном размере внутри митохондрии, (по сравнению с деситекратным увеличение для монокатионов), давая 100-1000 кратное увеличение по сравнению с монокатионами. Подобное увеличение было бы весьма значительным в усовершенствовании разрабатываемой терапии.
Рисунок 36: Моно- и дикатионы трифенилфосфония

Мало что известно про взаимодействие липофильных дикатионов с митохондриальной мембраной и про пределы накопления дикатионов в митохондриях. Было проведено всего несколько экспериментов по взаимодействию дикатионов с митохондриями и ни один из них не показал, что дикатионы накапливаются в соответствии с уравнение Нернста [76]. Липофильные катионы проходять сквозь мембраны за счет гидрофобности катиона и низкой энергии Бора. Энергия Бора для дикатионов в четыре раза выше чем для монокатионов, а значит дикатионы должны быть более гидрофобными, чтоб переноситься через мембраны наравне с монокатионами.

После проведения ряда экспериментов стало ясно, что дикатионы накапливаются в митохондриях при повышении мембранного потенциала примерно на 90-100мВ. Потому нецелесообразно применять дикатионы в роли векторов для доставки антиоксидантов в митохондрии. При низком мембранном потенциале (in vitro) дикотионов значительно больше нежели монокатионов, поэтому дикотионы могут использоваться для измерения мембранного потенциала.

Представляет очень большой интерес изучение как функций и механизмов действия естественных антиоксидантов клетки, так и их аналогов и дальнейшее возможное их терапевтическое применение. Окислительный стресс с накоплением в тканях и биологических жидкостях АФК и вторичных продуктов оксидативно модифицированных молекул обнаружены при многих (более 60) болезнях и патологических синдромах, нередко называемых свободно-радикальной патологией: старении тканей и всего организма, различных злокачественных процессах, хроническом воспалении (ревматоидный артрит, гастрит и язва, колиты, цистит и другие), СПИДе, сахарном диабете, атеросклерозе, последствиях инфаркта и инсульта, катаракте, нейродегенеративных заболеваниях (паркинсонизм, болезнь Альцгеймера и другие) и многих других. Вот только первично ли возникновение АФК или же накопление их является следствием патогенеза пока не совсем ясно. Несомненно, что избыточность АФК повреждает клетки и тем самым способствует развитию заболеваний, поэтому-то и необходимо изучение и создание новых неприродных антиоксидантов, которые совместно с клеточными антиоксидантами могли бы поддерживать АФК на допустимом для нормального фнкционирования клетки уровне.





Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница