Тема Введение в предмет Понятие «культуры клеток»



страница1/5
Дата21.10.2018
Размер0.8 Mb.
#57325
  1   2   3   4   5

Тема 1. Введение в предмет


  1. Понятие «культуры клеток». Общие принципы культивирования растительных и животных клеток.

  2. Способы культивирования растительных и животных клеток.

  3. Использование культур клеток растений и животных для решения фундаментальных задач биологии.

  4. Направления практического использования культур растительных клеток.

  5. Направления практического использования животных клеток.

Цель курса «Культуры эукариотических клеток» – знакомство с методами получения культур клеток, их ведения, а также практическим использованием этих объектов

Культуры клеток – это клетки, растущие или сохраняющие жизнеспособность при культивировании вне организма (в условиях in vitro)

Клеточные технологии включают:



  • культивирование растительных клеток;

  • культивирование животных клеток.

Клеточные технологии базируются на двух основных принципах. Главное требование – соблюдение строгой асептики. Все работы по получению культур растительных и животных клеток, их пересадкам производятся в ламинар-боксах. Второе условие – использование специальных питательных сред. Культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Для культивирования растительных и животных клеток требуются многокомпонентные питательные среды. Среды для культивирования растительных клеток включают 20-25 компонентов. Количество компонентов отдельных питательных сред для культивирования животных клеток может достигать 60.

Существует два способа культивирования растительных клеток: поверхностное культивирование на плотной (агаризованной) питательной среде (каллусные культуры) и глубинное культивирование клеток в жидкой питательной среде (суспензионные культуры).



Каллус – недифференцированные растительные клетки, выращиваемые поверхностным способом на полутвердой питательной среде. Каллус может образоваться не только в искусственных условиях, но и в природе, например, на раневой поверхности. Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок и служит для восстановления (регенерации) утраченных органов

Суспензионная культура – отдельные клетки или клеточные агрегаты, выращиваемые в жидкой питательной среде во взвешенном состоянии Необходимое условие для поддержания суспензионных культур – постоянное перемешивание питательной среды

Способы культивирования животных клеток также включают два варианта: культивирование на поверхности культурального сосуда в виде монослоя (монослойные культуры) и глубинное культивирование в жидкой питательной среде (суспензионные культуры).



Монослойные культуры – культуры, клетки которых размножаются в форме монослоя, прикрепившись к субстрату

Суспензионные культуры – культуры, клетки которых способны расти будучи суспендированными в питательной среде

Культуры клеток растений и животных широко используются для решения фундаментальных задач биологии.

Культуры клеток представляют собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях, в связи с чем представляют собой удобные модели для изучения действия на клеточном уровне физических, химических и биологических факторов.

Преимущества культур клеток в качестве модельных объектов:

1. Клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, при работе с ними исследуемые соединения (яды, гормоны, лекарственные препараты, косметические средства и т.д.) могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода времени, а также исчезает опасность того, что соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками.

2. Исследователь может изменять условия культивирования в определенных пределах, что позволяет ему оценивать влияние на состояние клеток самых различных физических факторов (температуры, УФ-облучения и т.д.).

3. Быстрота получения результатов, т.к. рост клеток может быть оценен в течение короткого периода времени, например, по увеличению их числа или размера.
Метод культуры клеток – неотъемлемая составная часть генной инженерии, клеточной инженерии и других направлений экспериментальной биологии.

Генная инженерия – совокупность методик, позволяющих выделять нужный ген из генома одного организма и вводить его в геном другого организма

Клеточная инженерия – конструирование клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции

Направления практического использования культур растительных клеток:



  1. Получение биологически активных веществ.

2. Клональное размножение растений.

3. Получение растений, оздоровленных от вирусной, бактериальной и грибной инфекций.

4. Ускорение селекционного процесса на основе методов клеточной инженерии.

5. Получение трансгенных растений.

6. Сохранения генофонда высших растений.
Направления практического использования культур животных клеток.

1. Получение биологически активных веществ.

2. Тестирование и изучение механизма действия различных веществ (гормонов, лекарственных препаратов, детергентов, косметических средств, инсектицидов, консервантов).

3. В медицине при решении следующих задач:

- исследование механизмов перерождения нормальных клеток в опухолевые;

- изучение тканевой несовместимости и других иммунных реакций;

- в онкологии для оценки противоопухолевых средств (культуры опухолевых клеток);

- реконструкция различных поврежденных тканей и органов путем трансплантации нормальных здоровых клеток, выращенных in vitro.

4. Клонирование животных.

5. Получение трансгенных животных.

6. Создание банков клеточных линий.
Тема 2. Обеспечение асептических условий в технологии культур клеток растений и животных


  1. Условия асептики при выполнении работ с культурами клеток.

  2. Стерилизация рабочего помещения, требования к рабочему персоналу.

  3. Ламинар-боксы, варианты подачи воздуха в рабочем объеме, классы биологической безопасности.

  4. Стерилизация посуды, инструментов.

  5. Стерилизация питательных сред.

  6. Контроль стерильности и контаминации клеточных культур.

Основное условие успешного культивирования – СТЕРИЛЬНОСТЬ. Загрязнение (контаминация) бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами приводит к гибели клеточных культур

Стерилизация – полное уничтожение микроорганизмов и их покоящихся форм (например, спор). Существуют разные методы стерилизации:


  • с помощью влажного пара (автоклавирование);

  • с помощью сухого пара;

  • облучение ультрафиолетовыми лучами;

  • обработка химическими веществами;

  • микрофильтрация

При работе с культурами растительных и животных клеток стерилизации должны подвергаться:

  • операционная комната, в которой производят изоляцию и посадку культур;

  • одежда и руки работающего персонала;

  • посуда, используемая для культивирования клеток;

  • все необходимые инструменты и материалы;

  • питательные среды;

  • объекты культивирования

Стерилизация рабочего помещения. Для работы с культурами клеток необходимо иметь специальные операционные комнаты либо боксы (чистые помещения/боксы). Стены, пол и потолок операционных комнат должны быть покрыты не сорбирующими пыль и моющимися покрытиями. Чистые помещения создаются и используются в медицине, фармакологии, на предприятиях электронной промышленности, а также для научных исследований (работа с культурами клеток). Стерилизация операционной комнаты включает ежедневное тщательное удаление загрязнений и пыли со всех поверхностей с помощью мыльного раствора либо 1-3%-го раствора хлорамина; УФ-облучение перед работой в течение 30 минут

Рабочий персонал должен владеть техникой работы в асептических условиях. Предотвращение микробной контаминации через человека достигается применением защитной рабочей одежды.



Ламинар-бокс. Позволяет в любом помещении создать стерильный рабочий объем, необходимый для работы с культурами клеток. Он обеспечивает постоянный обдув места проведения работ (рабочей поверхности) стерильным ламинарным потоком воздуха. Ламинарное движение воздуха – движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Очистка воздуха проводится путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор. К фильтрам тонкой очистки относятся HEPA-фильтры. HEPA (High Efficiency Particulate Air или High Efficiency Particulate Absorbing) означает «высокоэффективное удержание частиц». По мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменяется. Ламинар-боксы имеют встроенные источники освещения, УФ-облучения.

В зависимости от устройства ламинар-бокса поток воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным или вертикальным. В ламинар-боксах с горизонтальным потоком воздуха поток очищенного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. Такое оборудование используется при работе с заведомо непатогенным материалом. В ламинар-боксах с вертикальным потоком воздуха воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена. Могут быть использованы для работы с потенциально патогенным материалом. С помощью вентиляторов в приборе обеспечивается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство (20-35%), а остальной (65-80%) поток повторно проходит через НЕРА-фильтр и вновь поступает в рабочий объем. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращается созданием зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Передняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс оснащен индикатором загрязнения фильтра тонкой очистки. Преимущества ламинарных шкафов с вертикальным потоком воздуха заключаются в отсутствии постоянного обдува оператора и блокирования потока воздуха, вызванного крупными объектами. При работе в ламинар-боксе с вертикальным потоком воздуха категорически запрещается проносить руки работающего персонала, нестерильные предметы над открытой поверхностью стерильных культуральных сосудов.

Классы биологической безопасности ламинар-боксов:

1. Боксы биологической безопасности класс I (защита оператора и окружающей среды). Обеспечивает удаление контаминации, создаваемой в боксе, с помощью входящего воздушного потока через окно оператора с последующей эффективной его фильтрацией. Нет защиты продукта от внешних загрязнений

2. Боксы биологической безопасности класс II (защита продукта, оператора и окружающей среды). Чаще всего применяются при работе с культурами растительных и животных клеток и тканей.

3. Боксы биологической безопасности класс III (ультра-защита продукта, оператора, окружающей среды). Применяются при работе с особо опасным микробиологическим материалом, вирусами, бактериями; при работе с радиоизотопами, канцерогенами; при сборке электронных компонентов, а также в фармацевтике, криминалистике, органическом синтезе.



Стерилизация посуды. Успех культивирования клеток во многом зависит от строгого соблюдения правил проведения подготовительных работ по мойке, стерилизации лабораторной посуды и инструментов. Для культивирования растительных и животных клеток используют стеклянную либо пластиковую посуду. Пластиковая посуда одноразового использования поступает в стерильном виде. Стеклянная культуральная посуда используется многократно, перед употреблением должна быть тщательно вымыта и затем простерилизована. Для мытья посуды следует использовать нетоксичные детергенты. В растворе детергентов посуда выдерживается несколько часов, затем тщательно промывается проточной водой, а затем дистиллированной водой (споласкивается несколько раз)

Способы стерилизации посуды:



  • сухим горячим жаром в сушильном шкафу. Продолжительность стерилизации при 160 °С – 180 °С – в течение 3 часов.

  • автоклавирование при 2 атм (134°С) в течение 25-30 мин.

Перед стерилизацией все отверстия в стеклянной посуде (горлышки бутылей, флаконов) заворачиваются в двойной слой фольги

Стерилизация инструментов. Включает два этапа:



  • предварительная

(сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 ч при 140°С; кипячением);

  • непосредственная

(в ламинар-боксе инструменты стерилизуют еще раз, помещая в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени спиртовки).

Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции!



Стерилизации питательных сред. Достигается с помощью следующих способов: термическая стерилизация и фильтрующая стерилизация.


Способ стерилизации

Питательные среды для культур растительных клеток

Питательные среды для культур животных клеток

Автоклавирование

0,5 атм избыточного давления (112ºС)

1,0 атм избыточного давления (121ºС)

Фильтрование

Мембраны с диаметром пор 0,22-0,45 мкм

Мембраны с диаметром пор 0,22 мкм

Главное преимущество термической стерилизации по сравнению с другими способами – надежность; один главный недостаток – разрушение термолабильных компонентов питательной среды. Питательные среды, не содержащие термолабильных веществ, стерилизуют автоклавированием при давлении 0,5–1 атм. Продолжительность стерилизации зависит от объема среды в сосуде. Культуральные сосуды со средой объемом 25–50 мл стерилизуют в течение 15–20 мин, объемом 2–4 л – в течение 30–40 мин. Другим способом стерилизации может быть дробная стерилизации – тиндализация, которую проводят при температуре 100 С и атмосферном давлении. Среду кипятят в течение 10 мин, затем охлаждают ее и повторяют эту процедуру дважды с промежутком в одни сутки. Для стерилизации растворов с термолабильными соединениями (растительные экстракты, белки, аминокислоты, витамины, антибиотики, некоторые стимуляторы роста), которые разрушаются при автоклавировании, применяют метод фильтрующей стерилизации.



Контроль стерильности и контаминации клеточных культур. Если культура растительных клеток загрязнена быстрорастущими микроорганизмами, то такое заражение легко обнаруживается уже на 2-3 сутки после посадки. Заражение культуры проявляется в виде ореола из бактериальной или грибной инфекции на поверхности агара вокруг каллуса. Если инфицирована питательная среда, то колонии микроорганизмов распределяются в толще агарового слоя. Суспензионная культура растительных клеток приобретает вид разбавленного молока.

Признаки контаминации культур животных клеток:



  • опалесценция или помутнение культуральной среды;

  • резкое закисление питательной среды (в питательные среды для культивирования животных клеток добавляют индикатор феноловый красный, который позволяет контролировать рН среды в любой момент времени);

  • изменение ростовых характеристик и морфологии клеток;

  • неспецифическая дегенерация клеточного монослоя;

  • массовая гибель клеток в суспензионных культурах.

Проверку материала на контаминирование вирусами проводят в вирусологических лабораториях с помощью специальных методов. Заражение культуры микоплазмой не выявляется невооруженным глазом, не приводит к изменению роста культуры, однако существенно изменяет биохимию клеток. Следует один раз каждые 1-3 мес проверять культуры на наличие в них микоплазмы.
Тема 3. Физиолого-биохимические основы культивирования клеток растений


  1. Общие требования к лаборатории по культивированию растительных клеток и тканей.

  2. Основные компоненты питательных сред и их назначение при культивировании клеток растений.

  3. Роль фитогормонов ауксиновой и цитокининовой природы.

  4. Физические условия культивирования.

  5. Ростовой цикл каллусных и суспензионных культур.

Для работы с культурой клеток растений необходимо следующее:



  1. ламинар-бокс для асептической пересадки;

  2. место для приготовления питательных сред;

  3. культуральная комната (комната с постоянной температурой, режимом освещения либо термостат либо климатическая камера);

  4. качалки ротационного типа для суспензионных культур.

Главные практические аспекты получения культуры и ее поддержания группируются вокруг проблемы подбора подходящей среды для культивирования

Компоненты среды для выращивания растительных объектов in vitro условно можно разделить на 5 групп:



  • макроэлементы;

  • микроэлементы;

  • источник углерода;

  • витамины;

  • регуляторы роста.

Основой всех питательных сред для культивирования растительных клеток является смесь минеральных солей. Минеральная основа питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей должна включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, серу, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.). В состав макроэлементов входят соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимые соли К+, Са2+, Мg2+. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Поскольку питание большинства культивируемых тканей является гетеротрофным, то обязательным компонентом питательных сред является источник углерода и энергии. В большинстве сред, используемых для культур растительных тканей, таким источником является сахароза и глюкоза, обычно в концентрациях 2040 г/л. Сахароза в результате автоклавирования при стерилизации сред гидролизуется до более доступных к усвоению моносахаридов. В отдельных экспериментах можно получить автотрофные культуры. Однако, как правило, даже в случаях получения автотрофных культур для нормального роста хлорофиллоносных тканей необходимы углеводы.

В состав большинства питательных сред для культивирования клеток и тканей растений входят витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновая кислота, пиридоксин, аскорбиновая кислота.

Содержание регуляторов роста обычно является определяющим фактором для успешного роста культур клеток растений. Для индукции каллусогенеза в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины (вызывающие клеточную дедифференцировку) и цитокинины (индуцирующие деление дедифференцированных клеток). На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» ткани. Автономность по отношению к обоим классам гормонов или к одному из них связана со способностью этих клеток продуцировать значительные количества ауксинов и цитокининов.

В качестве ауксинов в питательных средах наиболее часто используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), 1-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Для индукции каллуса обычно необходимы высокие концентрации ауксинов (чаще это 2,4-Д), но при последующих пересадках их уменьшают. Ауксины необходимы для стимуляции деления и растяжения клеток каллусных и суспензионных культур; стимуляции образования корней (ризогенеза); в сочетании с другими фитогормонами для формирования у протопластов клеточных стенок. Синтетические ауксины (2,4-Д, НУК) обладают более высокой биологической активностью по сравнению с природными (ИУК, ИМК).

В качестве цитокининов искусственные питательные среды могут содержать кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин. Цитокинины включают в состав сред для стимуляции клеточных делений в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов; индукции процессов образования побегов (стеблевой морфогенез). 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином.

Для приготовления твердых питательных сред в качестве уплотняющего вещества используют агар-агар в конечной концентрации 6–10 г/л. Он образует с водой гель, плавящийся при 100 С и затвердевающий при 45 С. Агар-агар теряет способность образовывать гель в кислой среде. Некоторые компоненты агара могут отрицательно влиять на рост, поэтому при работе с культурами клеток растений важно использовать агар хорошего качества. Кроме агара в качестве загустителей питательных сред могут выступать фитогели.

В нативных условиях растительная клетка функционирует в узких пределах колебаний кислотности среды. Большинство культур изолированных тканей растет на средах с рН 5,5–5,8. Обычно рН готовой среды устанавливается с помощью 10 %–ного или 1 н раствора KOH или NaOH или 1 н HCI перед автоклавированием. Однако надо учитывать, что после автоклавирования рН среды может снижаться.

В настоящее время выпускают несколько типов готовых сред в виде сухих порошков, содержащих все необходимые элементы, за исключением регуляторов роста, сахарозы и агара. Коммерческие среды весьма удобны для обычного культивирования. Однако у них есть ряд недостатков: они дороги, а их применение ограничено для исследований, в которых необходимо варьирование компонентов сред.

Наиболее часто используемой средой по праву можно назвать среду Мурасиге и Скуга. Минеральная основа этой среды была подобрана авторами для каллусной ткани табака сорта «Висконсин», возникшей на экспланте – паренхиме стебля в средней его части. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других соотношением аммонийного и нитратного азота. Она подвергается разным модификациям, что реже относится к макро- и микроэлементам минеральной основы и чаще касается набора витаминов, гормональных и других регуляторных факторов. Среда Мурасиге и Скуга дает хорошие результаты при каллусообразовании у большинства растений, хорошо поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинства двудольных.

Среда Гамборга и Эвелега (среда В-5) используется при культивировании клеток и тканей бобовых растений и злаков.

Среда Уайта служит для укоренения побегов и нормального роста стеблевой части после регенерации.

Среда Ничей рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников, а также морфогенеза у злаков.

Среда Као и Михайлюка применяется для культивирования единичных (или с малой плотностью высева) изолированных протопластов и клеток.

От состава питательной среды в значительной мере зависит успех выращивания клеток, тканей, органов растений. Поэтому разработке и совершенствованию состава сред уделяется много внимания.

Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные физические условия выращивания.

Температурный фактор оказывает значительное влияние на рост в условиях in vitro, активность ферментов, часть из которых является необходимой для метаболизма источников питания и др. Температура в камерах фитотрона в большинстве лабораторий поддерживается на уровне 261 С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29–30 С.

Условия освещения также оказывают влияние на рост изолированных клеток, тканей и органов растений. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как они не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000–4000 лк. Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света. Свет разной длины волны регулирует процессы первичного и вторичного метаболизма. Также необходимо учитывать фотопериод.

Влажность в культуральной комнате должна составлять 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Наилучший световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.

При поверхностном и суспензионном выращивании клеточных популяций важное значение имеют условия аэрации и состав газов. Хотя оптимальные условия газового режима в культуре клеток и тканей остаются малоизученными, известно, что в зависимости от газовой смеси (кислород, азот, углекислота) резко изменяется как интенсивность клеточного деления, так и процессы дифференцировки и формообразования.

Наиболее важной характеристикой популяции является ее рост. Обычно рост популяции клеток in vitro оценивают по числу составляющих ее клеток или по их общей биомассе. В целом клетки in vitro проходят фазы ростового цикла, характерные для роста клеток высших растений in vivo.

Ростовой цикл, или цикл выращивания, – это период от помещения инокулюма на свежую питательную среду до следующего субкультивирования. Рост клеточных культур описывается S-образной кривой. Различают несколько фаз ростового цикла (рис. 1).

Лаг–фаза – начальный период в ростовом цикле, в котором клетки не размножаются и не увеличиваются в размерах. Однако на протяжении этого периода в клетках происходят важные изменения, направленные на подготовку и вступление их в фазу активного деления.

Логарифмическая фаза – это ограниченный период в ростовом цикле, в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления, и как следствие – увеличение сухого вещества. В течение поздней экспоненциальной фазы наблюдается замедление клеточного деления, а увеличение биомассы происходит за счет растяжения клеток.



Линейная фаза очень короткая. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянная.

Наступление фазы замедления роста обусловлено истощением питательной среды (в основном источников углеводного, азотного и фосфорного питания). В течение этой фазы размер клеток еще продолжает возрастать, однако количество клеток не изменяется.



Стационарная фаза – период ростового цикла, в ходе которого каллусная или суспензионная культура достигает максимума сухого веса. В культуральной среде накапливаются продукты жизнедеятельности клеток, угнетающие рост культуры. В клетках резко уменьшается объем цитоплазмы, вакуоль достигает максимальной величиныДля того чтобы не наступила гибель клеток, необходима пересадка культуры на свежую питательную среду.

Рост можно регулировать различными факторами и оценивать по таким показателям как размер, объем, масса, число клеток, количество белка и ДНК. Тот или иной показатель используется в зависимости от целей эксперимента.





Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4   5




База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница