Влияние моделирования эффектов микрогравитации на цитоскелет и экспрессию генов у мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга человека in vitro 14. 03. 08 авиационная, космическая и морская медицина 03



Скачать 446.9 Kb.
страница1/3
Дата23.06.2018
Размер446.9 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3



На правах рукописи

ГЕРШОВИЧ

Павел Михайлович


Влияние моделирования эффектов микрогравитации на цитоскелет и экспрессию генов у мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга человека in vitro

14.03.08 – авиационная, космическая и морская медицина

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 


А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН


Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Оганов Виктор Сумбатович доктор биологических наук, профессор Киселев Сергей Львович



Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится «16» сентября 2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ – ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН
Автореферат разослан « »______________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,



доктор биологических наук М.А. Левинских
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Гравитация является фундаментальным механическим фактором, определяющим особенности эволюции и структурно-функциональной организации живых организмов на Земле. Известно, что в условиях микрогравитации происходят атрофические перестройки костной ткани, выраженность которых во многом зависит от расположения кости по отношению к вектору гравитации [Ступаков Г.П., Воложин А.И., 1989; Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1997; Оганов В.С., Богомолов B.B., 2009; Vico L. et al., 2001]. Локальная потеря массы костной ткани в условиях дефицита механической нагрузки или микрогравитации позволяет предположить, что рецепция механического сигнала (или его отсутствия) может осуществляться, в том числе и на клеточном уровне. Обусловленное микрогравитацией изменение способности костной ткани к самовозобновлению указывает на то, что в этот процесс могут быть вовлечены стволовые клетки и остеогенные клетки-предшественники. Не исключено, что пусковым механизмом могут служить различные изменения в структурах цитоскелета клеток остеогенной природы. В ряде недавних работ было показано участие определенных структур цитоскелета стволовых клеток в выборе пути их дифференцировки [Sordella R. et al., 2003; McBeath R. et al., 2005]. Цитоскелет живой клетки наряду с мембранными компонентами является одной из ведущих базовых структур клетки, обеспечивающих ее морфологическую целостность и функциональную активность. Ремоделирование актинового цитоскелета происходит под влиянием факторов различной природы: факторов роста, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами, а также при действии механических сигналов [Юдинцева Н.М. и др., 2008; Buravkova L.B. et al., 2001; Bershadsky A.D. et al., 2003; Crawford-Young S.J., 2006]. Существуют исследования, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета и ассоциированных с ним внеклеточных и внутриклеточных белков в процессах проведения сигнала и регуляции экспрессии генов [Пинаев Г.П., 2009; Aplin A.E., et al., 1998; Janmey P.A., 1998]. Кроме того, показано, что в ходе остеогенной дифференцировки мезенхимальных клеток-предшественников организация актинового цитоскелета изменяется [Rodríguez J.P. et al., 2004]. Однако, по-прежнему, остается неясной роль цитоскелета, как потенциально гравитационно-чувствительной структуры клеток, в механизмах их адаптации к микрогравитации, а также в том, какое значение могут иметь перестройки цитоскелета или изменения в экспрессии генов компонентов цитоскелета для нормальной функциональной активности клеток-предшественников. Мультипотентные мезенхимальные стромальные или стволовые клетки (ММСК) являются популяцией клеток-предшественников стромы костного мозга [Pittenger M.F. et al., 1999; Conget P.A., Minguell J.J., 1999; Caplan A.I., Bruder S.P., 2001; Bianco P. et al., 2001]. Дифференцировочный потенциал, а также другие особенности функционирования этих клеток могут быть сравнительно легко изучены в культуре, в том числе и при оценке влияния различных физических факторов [Altman G.H. et al., 2002; Sordella R.et al., 2003; McBeath R. et al., 2005]. Перспективность всестороннего изучения биологии ММСК, а также их клинического использования определяется, прежде всего, их способностью восстанавливать дефекты и повреждения соединительных тканей (костной, хрящевой и мышечной). Точные молекулярные механизмы гравитационной чувствительности ММСК и более коммитированных остеогенных клеток-предшественников остаются не до конца ясными, что обусловлено сложностью объекта исследования, многоуровневой системой регуляции их дифференцировочного потенциала и функциональной активности. В частности, показано, что моделирование эффектов микрогравитации приводит к ингибированию остеогенной дифференцировки ММСК и преостеобластов и к активации программы адипогенной дифференцировки ММСК [Zayzafoon M. et al., 2004; Meyers V.E. et al., 2004; 2005; Pardo S.J. et al., 2005; Dai Z.Q. et al., 2007; Patel M.J. et al., 2007; Pan Z. et al., 2008; Gershovich J.G. et al., 2008; Capulli M. et al., 2009; Huang Y. et al., 2009], что выражается в подавлении уровня экспрессии определенных генов-маркеров остеогенного коммитирования, и связывается с перестройками актинового цитоскелета клеток и изменением уровня экспрессии ассоциированных с цитоскелетом механочувствительных адгезивных рецепторов клетки (интегринов). В целом, исследования, посвященные изучению гравитационной чувствительности ММСК in vitro, по-прежнему, весьма немногочисленны. Таким образом, изучение состояния цитоскелета и молекулярно-генетических свойств ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации является актуальным вопросом, решение которого позволит приблизиться к более глубокому пониманию процессов, происходящих с клетками-предшественниками в условиях реальной микрогравитации.
Цель работы: изучение особенностей организации цитоскелета, ассоциированных с ним элементов и молекулярно-генетическая характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека в условиях моделирования эффектов микрогравитации.
Задачи исследования:
1) изучить динамику реорганизации актинового и тубулинового цитоскелета культивируемых ММСК на различных этапах наземного моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM;

2) исследовать адгезивные свойства ММСК и экспрессию некоторых рецепторов адгезии при моделировании эффектов микрогравитации;

3) оценить уровень экспрессии генов основных белков цитоскелета и ассоциированных с ним элементов на различных этапах наземного моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM;

4) провести профилирование экспрессии 84 генов – «маркеров стволовых клеток человека» с помощью наборов Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array на различных этапах наземного моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM;

5) провести анализ уровня экспрессии ключевых маркеров остеогенной дифференцировки ММСК при длительном моделировании эффектов микрогравитации.
Научная новизна.

• Впервые показано, что моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM приводит к реорганизации актинового цитоскелета ММСК костного мозга человека уже после нескольких минут воздействия, которая является обратимой при более продолжительной экспозиции (120 часов) и при статической ре-адаптации в течение 24 часов, и потере ими периферических винкулиновых сайтов фокальной адгезии, не влияя на организацию тубулинового цитоскелета клеток.

• Впервые выявлена динамика изменения уровня экспрессии генов цитоскелета в ММСК. В частности, показано, что экспозиция на RPM вызывает транзиторное изменение уровня экспрессии структурных и регуляторных генов, связанных с актиновым цитоскелетом, наиболее выраженное на этапе 48 часов, которое частично компенсируется на конечных сроках экспозиции (120 часов) и полностью при ре-адаптации клеток в статических условиях в течение 24 часов, что может отражать процесс адаптации цитоскелета к моделированию эффектов микрогравитации.

• Впервые установлено, что моделирование эффектов микрогравитации (120 ч) приводит к достоверному изменению паттерна экспрессии генов - «маркеров стволовых клеток» (Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array, SABiosciences) в ММСК костного мозга человека. При этом, моделирование эффектов микрогравитации вызывает как активацию, так и угнетение экспрессии 54 различных генов, кодирующих белки, принимающие участие во внутриклеточной сигнализации, клеточной адгезии, регуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.

• Показано, что коммитирование ММСК к остеогенезу в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации (10-20 сут) сопровождается снижением уровня экспрессии генов, кодирующих основные маркеры остеогенной дифференцировки клеток, в том числе и ключевого мастер-транскрипционного фактора, контролирующего программу остеогенной дифференцировки ММСК – RUNX2.

Теоретическая и практическая значимость работы.
Обнаруженные структурные и молекулярно-генетические изменения в культурах ММСК свидетельствуют о наличии гравитационно-зависимых внутриклеточных механизмов, которые обуславливают как ранние, так и поздние ответные реакции клеток-предшественников на моделирование эффектов микрогравитации. Полученные приоритетные данные существенно дополняют имеющиеся теоретические представления о механизмах восприимчивости клеток-предшественников взрослого организма к изменению параметров гравитационной среды, по крайней мере, в условиях in vitro и о роли актинового цитоскелета, как базовой структуры клеток, в том числе и стволовых, в качестве гравитационно-сенсорной клеточной структуры. Результаты работы подтверждают возможность использования мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека в качестве удобной экспериментальной модели для изучения роли гравитации и микрогравитации в процессах функционирования и дифференцировки клеток-предшественников взрослого организма, а также для исследования механизмов клеточной гравитационной чувствительности. Полученные в работе результаты являются основой для разработки проекта технического задания для проведения космического эксперимента с целью дальнейшего изучения морфофункциональных и молекулярно-генетических свойств ММСК в условиях микрогравитации.

Положения, выносимые на защиту:
1. Актиновый цитоскелет и ассоциированные с ним элементы представляют собой гравитационно-чувствительные структуры клетки, которые наиболее быстро реагируют на постоянное изменение положения ММСК в пространстве, что подтверждается наблюдаемой транзиторной реорганизацией актинового цитоскелета, и изменением в уровне экспрессии связанных ним структурных и регуляторных генов, начиная с самых ранних сроков экспозиции на RPM (30 мин - 48 ч). Восстановление структуры актинового цитоскелета ММСК на более поздних этапах (120 ч) сопровождается активацией адгезии клеток и частичным восстановлением уровня экспрессии цитоскелетных генов, что может быть важным звеном в механизме адаптации цитоскелета клеток-предшественников к условиям моделирования эффектов микрогравитации.

2. Под влиянием моделирования эффектов микрогравитации в ММСК человека происходит как угнетение, так и активация экспрессии ряда генов, отвечающих за поддержание свойств мультипотентности и дифференцировки стволовых клеток различных типов. В отличие от генов, связанных с актиновым цитоскелетом, паттерн экспрессии генов, кодирующих маркеры «стволовых клеток» в ММСК человека, наиболее значительно изменяется после 120 часов экспозиции в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM, что отражает временные различия между механизмами изменения экспрессии структурных и регуляторных генов, ответственных за различные типы внутриклеточных процессов в стволовых клетках.

3. Подавление процесса индуцированной остеогенной дифференцировки ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM может быть обусловлено как угнетением экспрессии генов, кодирующих ключевые маркеры остеогенной дифференцировки клеток, а именно, RUNX2, ALPL и OMD, так и активацией экспрессии анти-остеогенных и про-адипогенных факторов, таких как PPARγ.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были доложены и обсуждены на: 7-й – 8-й Конференциях молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённых дню Космонавтики. Москва, 2008, 2009; 11-й, 12-й, 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино, 2007, 2008, 2010; International symposium «Biological motility»: Achievements and Perspectives. Pushchino. 2008; 29th Annual International Physiology Meeting. Angers. France. 2008; 17th Humans in Space Symposium. Moscow. 2009; French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach». Angers. France. 2010.
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 15.06.2010 г.


Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №08-04-01607-а, контракта с Роснауки № 02.518.11.7059 и программы Фундаментальных исследований ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 150 страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы состоит из 307 цитируемых источников, из которых 34 - на русском и 273 - на иностранном языке.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культивирование ММСК. Объектом исследования являлись культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека, любезно предоставленные д.б.н. Романовым Ю.А. (Научно-практическая лаборатория стволовых клеток человека НИИ РКНПК Росмедтехнологий). В качестве среды для поддержания роста ММСК использовали среду DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 г/л (Gibco, США), содержащую 2 мМ глутамина (MP Biomedicals, США), 1 мМ пирувата натрия, 12,5 мМ HEPES-буфера (Gibco или Sigma, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 μг/мл стрептомицина (Биолот, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США). Замену среды проводили каждые 3-4 дня. Культивирование в стандартных условиях проводили при 37оС в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония).

Моделирование эффектов микрогравитации. Для моделирования эффектов микрогравитации использовали Устройство для рандомизации положения - Random Positioning Machine (dRPM, Dutch Space, Leiden, The Netherlands). В процессе работы RPM происходит рандомизация положения объекта относительно вектора гравитации за счет разнонаправленного вращения двух взаимоперпендикулярных рамок, к которым крепится платформа с экспериментальными образцами, за счет чего имитируется эффект снижения влияния силы тяжести на культуру клеток [van Loon J.J.W.A., 2007]. В результате испытаний был выработан оптимальный набор предварительно устанавливаемых параметров вращения симуляции микрогравитации (100 радиан в мин для внешней рамки и 80 для внутренней, при активной функции смены направления вращения).

Индукция и детекция остеогенной и адипогенной дифференцировки ММСК костного мозга человека. Индукцию остеогенной и адипогенной дифференцировки ММСК проводили по общепринятым методикам [Jaiswal N. et al., 1997; Janderova L. et al., 2003]. Эффективность дифференцировки оценивали в случае остеогенеза - по активации экспрессии щелочной фосфатазы и накоплению минерализованных компонентов матрикса; в случае адипогенеза - по накоплению липидных капель в цитоплазме клеток и образованию кластеров адипоцитов.

Иммунофенотипическая характеристика клеток проводилась методом проточной цитофлуориметрии с помощью моноклональных антител (Beckman Coulter, Франция или Biolegend, США), меченых FITC (CD34, CD11b, CD90, CD44, HLA A,B,C, CD49b, CD54) и PE (CD45, CD29, CD73, CD105, CD106), на приборе Epics XL, Beckman Coulter, США.

Флуоресцентные исследования. Изменения в структуре белков цитоскелета ММСК: F-актина, β-тубулина и винкулина оценивали с помощью метода флуоресцентной микроскопии на микроскопе Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия), оснащенном сопряженной с ним цифровой черно-белой видеокамерой AxioCam HRm. После различных сроков экспозиции на RPM (30 минут, 6 часов, 24 часа, 48 часов, 120 часов и 24+24 часа ре-адаптации в статических условиях) клетки отмывали от среды, после чего фиксировали ледяным метанолом в течение 5 минут с последующей отмывкой. Для предотвращения неспецифического связывания антител, перед окрашиванием клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в 1% растворе БСА. Для визуализации структуры фибриллярного актина использовали стандартный краситель TRITC-фаллоидин в концентрации 50 мкг/мл (Sigma, США). Структуру микротрубочек цитоскелета оценивали путем окрашивания клеток в течение 1 часа антителами против β-тубулина (Sigma, США), коньюгированными с Cy3 в разведении 1:200, соответственно. Клетки инкубировали с антителами к винкулину (Chemicon, США), в разведении 1:100 в течение 2 часов. После инкубации клетки отмывали от избытка первичных антител 3 раза PBS и инкубировали 1 час с вторичными антителами, коньюгированными с FITC (Jackson Immunoresearch, США).

Анализ уровня экспрессии генов.

Выделение тотальной РНК, обратная транскрипция. Выделение тотальной РНК производили с помощью набора RNeasy PLUS mini kit (Qiagen, США). После этапа культивирования клетки снимали с подложки, отмывали, питательная среда удалялась центрифугированием, а полученные образцы консервировались при -35 оС с реактивом RNAlater (Qiagen, США). Согласно инструкции производителя, клетки (250 – 500 тыс) после удаления стабилизирующего реагента RNAlater центрифугированием (5 минут при 1000 об/мин) инкубировали на шейкере в лизирующем буфере RTL (поставляемым в наборе) в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее клеточный лизат переносили на колонки Qiashredder (Qiagen, США) и подвергали центрифугированию при 14000 об/мин в течение 2 минут, после чего к гомогенату клеток добавляли равное количество 70% этанола. Полученный раствор переносили на сорбционные колонки (поставляется в комплекте) и центрифугировали 30 сек при 10000 об/мин, супернатант удалялся. Далее производилась последовательная отмывка сорбционных колонок буферами RW1 (700 мкл) и RPE (500 мкл) с последующим центрифугированием 30 сек при 10000 об/мин. РНК смывали с колонок 50 мкл деионизированной воды. Полученные образцы РНК замораживали и хранили при -35 оС. Реакцию обратной транскрипции и получение кДНК на основе ранее выделенной РНК производили с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, США), согласно инструкции производителя.

ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени. Для определения уровня экспрессии генов с помощью ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени с помощью прибора MX3000P (Stratagene, США) применялся набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green 1, содержащий рекомбинантную ДНК-полимеразу HotStarTaq, смесь дезоксирибонуклеотидов и флуоресцентный краситель SYBR Green (Синтол, Россия). Количество кДНК на одну реакцию составляло 0,2 – 0,4 мкг. Конечный объем реакции составлял 25 мкл. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов применялись оптимизированные для метода Real-Time PCR пары праймеров QuantiTect Primer Assay (Qiagen, США) для каждого исследуемого гена: GAPDH – кат. № QT01192646, TBP - кат. № QT00000721, RHOА – кат. № QT00044723, ROCK - кат. № QT00034972,  CFL – кат. № QT00201348, VCL – кат. № QT00078302, TUBB – кат. № QT00089775, ACTB – кат. № QT00095431, ACTG – кат. № QT00996415, ACTA – кат. № QT00199815, RUNX2 – кат. № QT00020517, PPARG – кат. № QT00029841, BGLAP – кат. № QT0022771, COL1A1 – кат. № QT00037793, ALPL – кат. № QT00012957, OMD – кат. № QT0015953.

В качестве хаускиппинг-генов для определения относительного значения изменения уровня экспрессии изучаемых генов, были использованы гены глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) и TATA-домен связывающий протеин (TBP), так как их значение остается высококонсервативным для клеток костного мозга при различных условиях [Vandesompele J. et al. 2002]. При анализе данных разница в значении СТ 3.5 единицы соответствовала изменению уровня экспрессии в 10 раз, согласно указаниям производителя прибора. Специфичность проводимой реакции определялась с помощью анализа кривой плавления продуктов амплификации в диапазоне от 55 оС до 95оС с шагом 1 градус. Количество ПЦР-реакций при анализе уровня экспрессии каждого из исследуемых генов составляло не менее 15 - 20 повторов в рамках одного эксперимента. Профилирование экспрессии генов - маркеров стволовых клеток человека с помощью наборов Stem Cell RT² ProfilerPCR Array. Система анализа экспрессии Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array (SABioscienses, США) позволяет изучать экспрессию 84 генов клеток человека, вовлеченных в идентификацию, рост и дифференцировку стволовых клеток, с помощью метода ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени. В набор включены: гены, специфичные для стволовых клеток человека, гены, кодирующие белки, участвующие во внутриклеточной сигнализации и регуляции дифференцировки. Специфичные праймеры исследуемых генов и контроли качества реакции иммобилизованы в ячейках 96-ти луночных планшетов, адаптированных для использования с прибором MX3000P (Stratagene, США). Для проведения реакции ПЦР использовались наборы реагентов RT2-Real Time SYBR Green / ROX PCR master mix. Конечный объем реакционной смеси, согласно инструкции производителя, составлял 25 мкл. Количество кДНК в пересчете на одну реакцию – 0,2 – 0,4 мкг. Реакционная смесь переносилась в планшеты с иммобилизованными и лиофилизированными праймерами. После чего проводилась ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени. Для нормализации результатов исследования использовались 5 хаускиппинг-генов: B2M, HPRT1, RPL13A, GAPDH, ACTB, входящие в состав набора.



Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов вариационной статистики программы “Excel” для Windows XP. Статистическая обработка данных ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени осуществлялась с помощью программы REST 2009 v. 2.0.12, основные алгоритмы которой изложены в работе [Pfaffl M. et al., 2002]. Обработка данных профилирования экспрессии генов - маркеров стволовых клеток человека с помощью наборов Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array осуществлялась с помощью программного обеспечения, доступного на сайте производителя: http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php. Межгрупповые отличия считали достоверными при p≤0,05.

Каталог: webpages -> win1251 -> Science -> DisserSov -> Abstracts
Abstracts -> Характеристики активности спинальных механизмов в условиях микрогравитации 14. 00. 32. авиационная, космическая и морская медицина
Abstracts -> Актуальность проблемы
Abstracts -> Выявление допустимых нагрузок загрязняющих веществ на биосистему с высшими водными растениями 03. 00. 23 биотехнология
Abstracts -> Гемопоэз и метаболический статус эритроцитов мышей при длительном комбинированном воздействии ионизирующей радиации и химических веществ, моделирующем условия межпланетных полётов
Abstracts -> Физиологические пусковые стимулы изменения размеров волокон скелетных мышц при тренировке и гравитационной разгрузке 03. 00. 13 физиология 14. 00. 32 авиационная, космическая и морская медицина
Abstracts -> Список работ, опубликованных по теме диссертации
Abstracts -> Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия и кислорода 18 о на развитие лучевых повреждений в организме мелких лабораторных животных при низких дозах гамма-облучения 14. 00. 32 авиационная, космическая и морская медицина


Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3


База данных защищена авторским правом ©vossta.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница